王 新,譚建華,賴小平,萬忠海*,韋旭斌

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,山東青島266109;2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院,廣東廣州510006;3.解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春130062;4.吉林大學畜牧獸醫(yī)學院,吉林長春130062)

促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)脈沖頻率的改變是調(diào)節(jié)哺乳動物垂體促性腺激素亞單位基因表達的一個重要因素。促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH)均由兩個亞基組成,其中α亞基為兩者所共用,β亞基互不相同,決定了兩種激素的特異性。因此,要特異性的檢測Gn-RH脈沖頻率對FSH分泌的影響,應檢測FSH的β亞基或編碼亞基的mRNA對不同GnRH脈沖頻率所做出的不同應答反應。本文試驗利用細胞體外培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù),研究體外培養(yǎng)的大鼠原代垂體細胞在不同脈沖頻率GnRH刺激下,定量檢測不同脈沖頻率和振幅GnRH刺激時細胞內(nèi)FSHβ mRNA,確認細胞內(nèi)促性腺激素(gonadotropic hormone;gonadotropin;GTH)亞單位基因表達對不同GnRH脈沖頻率所做出的不同應答反應,從分子水平闡述不同脈沖頻率GnRH對GT H分泌FSH的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4月齡雌性Wistar大鼠,吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 GnRH(Sigma),凝膠回收試劑盒(Axygen),實時熒光定量PCR儀(ABI);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco);凝膠成像儀(Vilber);生物安全柜(Thermo Forma);CO2培養(yǎng)箱(Kendro)等。

1.2 方法

1.2.1 進行垂體前葉細胞體外原代培養(yǎng) 將大鼠斷頭,取垂體前葉細胞進行體外原代培養(yǎng)。分離到的垂體細胞,部分用于RNA的提取;部分細胞懸液調(diào)整到1×106個/mL,每孔1 mL移入24孔板中,共兩個培養(yǎng)板,放入37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 用不同脈沖頻率的GnRH對GT H細胞的刺激試驗 將GnRH的濃度定為20 nmol/L,刺激時間為30 min,間隔時間分別為30、60、120、240 min。每3孔為一組,另設3孔為陰性對照組(加無血清培養(yǎng)液),連續(xù)刺激24 h,棄培養(yǎng)液,胰酶消化后進行細胞計數(shù),取等量細胞用于總RNA的提取。

1.2.3 熒光定量標準品的制備 用Trizol提取垂體細胞總RNA,測OD值定量RNA濃度。根據(jù)GenBank中大鼠的FSH的序列設計的引物,以總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為反應模板進行PCR擴增,得到FSH和LH目的基因。再用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的基因片段,并將目的基因片段連接到pMD 19-T Vector上(選取合適比例進行連接反應),利用藍/白菌落篩選法進行陽性克隆的篩選。采用TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,完成熒光定量標準品的制備。用超純水將含有特異片段的重組質(zhì)粒(熒光定量標準品)溶液稀釋成每微升含1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103個拷貝的陽性質(zhì)控標準品。置—20℃保存。

1.2.4 熒光定量測定細胞FSHβ的表達量 將標準品設6個水平即1010、109、108、107、106、105copies/μ L,每個水平設2個重復,取GnRH振幅20 nmol/L,刺激頻率分別是30、60、120、240 min樣品和陰性對照組各1 μ L。設陰性質(zhì)控(NTC)。將除模板以外的其他組分充分混勻,按不同處理和檢樣的重復加1管進行第一次分裝,再加入模板,充分混勻后分裝各管。用熒光定量PCR儀測定細胞FSHβ和LHβ的表達量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計 采用生物統(tǒng)計軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,數(shù)值用Mean±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 細胞總RNA的提取與濃度測定

完整的RNA有3條帶,根據(jù)沉降系數(shù)可以分為28、18、5 S。從圖1中可以看出,較完整的RNA 28 S的條帶最亮,其次是18 S,5 S最模糊。260、280代表RNA溶液在260 nm和280 nm處吸光度,分別反映了RNA溶液的核酸和蛋白質(zhì)等有機物的吸光度(表1)。OD260/280體現(xiàn)了RNA溶液中的蛋白質(zhì)等有機物的污染程度,質(zhì)量較好的RNA OD260/280值應該在1.7～2.0之間。OD260/280＜1.7時,說明溶液中的蛋白質(zhì)等有機物的污染比較明顯;OD260/280＞2.0時,說明溶液中的RNA已經(jīng)被水解成了單核苷酸。從圖1和表1光密度值結(jié)果來看,提取的細胞總RNA沒有降解,完全符合反轉(zhuǎn)錄要求;OD260/280值介于1.7～2.0之間,達到實驗的純度要求。從圖3看,以重組質(zhì)粒為模板,采用FSHβ-FP和FSHβ-RP、LHβ-FP和LHβ-RP兩對引物進行常規(guī)PCR鑒定,電泳可見101 bp和124 bp特異條帶,與預期的片段大小相符。表明已成功制備陽性質(zhì)控標準品。

2.2 FSHβ基因的PCR擴增

結(jié)果見圖1,FSHβ目的基因片段,長度是101 bp(圖2)。

圖1 細胞總RNA電泳結(jié)果Fig.1 The eletrophoresis result of Total RN A from Cells

表1 總RNA光密度值及濃度結(jié)果T able 1 OD and concentration of total RNA

圖2 FSHβ和LHβ基因目的片段大小Fig.2 The length of FSHβ gene fragment

2.3 陽性質(zhì)控標準品重組質(zhì)粒的PCR鑒定

以重組質(zhì)粒為模板,采用FSHβ-FP和FSHβ-RP引物進行常規(guī)PCR鑒定,電泳可見101 bp特異條帶,與預期的片段大小相符(圖3)。表明已成功制備陽性質(zhì)控標準品。

圖3 FSHβ和LHβ重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果電泳圖Fig.3 Identification of FSHβ and LHβ recombinant plasmid by PCR

2.4 樣品FSHβ基因的熒光定量PCR結(jié)果

GnRH振幅為20 nmol/L,刺激頻率分別為30、60、120、240 min,對細胞中FSHβ基因進行熒光定量PCR,所得檢樣循環(huán)數(shù)與熒光強度的關系。每份樣品所含的拷貝數(shù)都可通過Ct值(熒光定量PCR反應過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù))與標準曲線比較而得到,熒光定量PCR儀ABI PRISM 7000可通過計算機處理直接給出定量結(jié)果。表2表明,當振幅一定、頻率為120 min時,FSH β mRNA的Ct值最小,拷貝數(shù)Qty最大,也就是說,當振幅一定,頻率為120 min時,FSHβ mRNA的表達水平最高。從分子水平解釋了為什么在頻率為120 min時,最有利于FSH的分泌。以上結(jié)果說明,引起FSH表達的最合適GnRH脈沖頻率是120 min。

表2 樣品中FSHβ的拷貝數(shù)Table 2 The number of copies of FSHβ in cells

3 討論

成年動物的生殖能力主要依賴于下丘腦-垂體-性腺軸的建立和完善,垂體處于軸系的中間環(huán)節(jié),分泌的促性腺激素(GTH)是參與生殖的重要激素。促性腺激素細胞分泌的促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)在哺乳動物生殖調(diào)控中占據(jù)中心地位,它們一方面與性腺內(nèi)各自受體結(jié)合,直接參與性腺功能的調(diào)控,另一方面又接受中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。近年來,Burger L L等[1],Shrim A等[2],Reichler I M等[3],Lisowski P等[4],Lopot M等[5],Akhter N等[6]進行了相關研究。GnRH是性腺軸上的最高一環(huán),主要由下丘腦促垂體區(qū)(主要是弓狀核內(nèi))肽能神經(jīng)元分泌,再由神經(jīng)突觸末端釋放進入垂體門脈系統(tǒng),刺激垂體前葉促性腺激素細胞合成釋放FSH和LH。促性腺激素又可以反饋到下丘腦,調(diào)節(jié)GnRH的分泌。這在指導實踐中得到大量應用,如近年來方富貴等[7],賓紅等[8],喬躍兵等[9]均有報道。歐陽五慶等[10]研究,下丘腦GnRH脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)GnRH間歇地釋放到垂體門脈循環(huán)中,進而調(diào)節(jié)LH和FSH的脈沖式分泌。LH和FSH都是由腺垂體的促性腺激素細胞合成分泌的,在大鼠的發(fā)情周期中,LH分泌有明顯的規(guī)律性。在發(fā)情前期,LH的分泌和釋放主要受GnRH的調(diào)控。FSH和LH的分泌規(guī)律是相似的,都是在發(fā)情前期有一個分泌高峰,在排卵后分泌較低。一般認為在體內(nèi)低頻低振幅有利于FSH的分泌。體外的情形已有許多報道證實是與體內(nèi)相似[11-13],我們的研究結(jié)果也證實了這一點。

在本試驗中,為了摸索FSH應答的最佳GnRH脈沖方式,利用實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR),研究了相同振幅條件下,4種脈沖頻率的GnRH刺激對FSH在mRNA表達水平上的影響。

用PCR對目的基因定量時,首先應考慮的是PCR擴增動力學的有關因素。每一次循環(huán)的PCR產(chǎn)物均是下一次循環(huán)的底物,模板的擴增呈指數(shù)式。隨著循環(huán)次數(shù)的增加,酶活性下降、溶液中反應物的消耗增加,擴增不再呈指數(shù)式進行,導致擴增產(chǎn)物的累積處于平臺期。在平臺期低水平表達的目的RNA可能會增加到與高水平表達目的RNA相同的濃度。因此定量時要保證循環(huán)次數(shù)在指數(shù)期內(nèi),才能保證PCR產(chǎn)物與模板量呈線性關系。本試驗選擇了處于指數(shù)期內(nèi)的45個循環(huán)為本試驗檢測FSH和LH的擴增循環(huán)數(shù),保證了PCR產(chǎn)物與模板量線性關系及結(jié)果的準確性。

GnRH脈沖頻率本身就是一個調(diào)控信號,不同脈沖頻率GnRH對FSH表達有著明顯不同的影響,在相同振幅條件下,低頻脈沖刺激(120 min間隔)時,FSHβ mRNA表達水平達到高峰,從分子水平闡述低頻GnRH脈沖刺激時FSH的分泌達到高峰的機理,支持了GnRH脈沖頻率本身就是一個調(diào)控信號的假說。

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