陳朝喜,朱恒乾,廖曉萍,劉雅紅*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院獸醫(yī)藥理與毒理學教研室,廣東廣州510642;2.西南民族大學生命科學與技術學院獸醫(yī)藥理學教研室,四川成都610041)

在抗生素壓力下,大腸埃希菌(Escherichia coli,E.coli)能夠形成生物被膜得以生存,導致對臨床抗菌藥物的敏感性降低[1]。同時生物被膜作為大腸埃希菌的毒力因子之一,常常引起持續(xù)性感染的遷延不愈[2-5]。因此,從研究耐藥譜型、基因型和生物被膜表型之間相互關系的角度探究生物被膜的耐藥機制,闡述抗菌藥物和生物被膜形成之間的相互作用,探討在不同抗生素壓力下生物被膜形成能力的變化,對大腸埃希菌流行病學研究和大腸埃希菌生物被膜感染疾病的防治藥物篩選具有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大腸埃希菌樣本來源 249株大腸埃希菌采自廣東省養(yǎng)殖場(禽類養(yǎng)殖場和養(yǎng)豬場,包括養(yǎng)殖場周圍的土壤和水塘樣本)和寵物醫(yī)院,大部分的樣本從患病動物的糞便、腸道內(nèi)容物和臟器分離。大腸埃希菌標準株ATCC 25922為華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)藥理教研室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,MH肉湯,蛋白胨大豆肉湯等為廣州環(huán)凱生物科技有限公司產(chǎn)品;分子生物學試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;ERIC-PCR通用引物由上海英駿生物工程有限公司合成(ER-F:5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′;ER-R:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)。

1.1.3 抗菌藥物 恩諾沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考、阿莫西林、利福平、氨芐西林、安普霉素、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻呋、鏈霉素、新霉素和卡那霉素由華南農(nóng)業(yè)大學實驗藥廠惠贈,臨用前配成5 120 μ g/mL備用。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 實驗步驟及結果判定按照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的微量肉湯稀釋法操作程序進行[6]。

1.2.2 249株臨床分離大腸埃希菌生物被膜表型分析 參照Peeters和Stepanovic等的微孔板法進行[7-8],具體方法如下:在無菌96孔細胞培養(yǎng)板的加入200 μ L經(jīng)1∶100稀釋的菌液,陰性對照孔只加入相應量的TSB肉湯,37℃培養(yǎng)24 h,然后棄去每孔內(nèi)培養(yǎng)液并用250 μ L滅菌PBS溶液漂洗3次以徹底棄去孔內(nèi)未黏附的浮游菌,孔壁上黏附的細菌用200 μ L 990 mL/L甲醇固定15 min后,棄去甲醇,室溫下自然風干。200 μ L 20 g/L結晶紫染色5 min,然后將96孔微量培養(yǎng)板浸沒在流動的自來水下沖洗干凈多余的染料。待微孔板過夜自然風干后,結合在孔內(nèi)的染料用160 μ L 330 g/L冰乙酸溶解,用酶標儀測定各孔的OD570值。每個細菌接種4孔,每個菌3次重復。根據(jù)測試孔與陰性對照孔OD570比值的不同,將所分離大腸埃希菌的生物被膜表型分為4個表型,即無成膜能力(—),弱成膜能力(+),中等成膜能力(++)和強成膜能力(+++)。

1.2.3 249株臨床分離大腸埃希菌耐藥性分析及其與生物被膜表型的關系 采用Whonet5.4軟件對臨床分離的249株大腸埃希菌的試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,按照耐藥譜型的不同進行分析匯總。結合1.2.2結果分析耐藥譜型與生物被膜表型之間關系。

1.2.4 大腸埃希菌生物被膜表型和基因型的關系

1.2.4.1 大腸埃希菌基因組DNA提取采用陶文琴等方法進行基因組DNA的抽提[9]。

1.2.4.2 ERIC-PCR反應體系及反應條件 采用腸桿菌科基因間重復一致序列引物進行擴增[10-11],ERIC-PCR的25 μ L PCR反應體系包括兩條引物(50 pmol)各1 μ L、DNA溶液2 μ L、dNTP混合物2 μ L、Ex Taq(5 U/μ L)0.25 μ L及2.5 μ L緩沖液,各組分加入后補充滅菌雙蒸水至25 μ L后充分混勻,按照下面的反應條件進行:94℃預變性5 min,然后接著35個循環(huán),循環(huán)條件為:94℃1 min,53℃1 min,72℃4 min,最后72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集。

1.2.4.3 ERIC-PCR指紋圖譜聚類分析 采用NTSYS pc 2.1軟件對ERIC-PCR指紋圖譜進行分析,得到Jaccard's遺傳相似性系數(shù)矩陣,采用非加權配對法做遺傳分析,繪制聚類分析樹狀圖譜。

2 結果

2.1 249株大腸埃希菌耐藥譜分布規(guī)律與成膜能力表型分析

249株不同成膜能力表型的大腸埃希菌的耐藥譜型分析匯總結果顯示,除了強成膜能力表型組的耐藥譜型比較分散外,其余3種表型的耐藥譜型主要集中在5～10耐之間(圖1)。強成膜能力組的耐藥譜型主要分布在4耐和7耐,分別占強成膜能力表型組的25.0%和37.5%。中等成膜能力組的耐藥譜型主要集中在7～10耐,占65.96%,其中7～10各耐藥譜分別占該表型的17.02%、19.15%、12.77%、17.02%。弱表型能力組的耐藥譜型在5～10耐的比例相差不大,集中了該耐藥譜型的81.39%,而5～10耐藥譜型分別占弱表型能力組的13.95%、13.18%、12.40%、13.18%、14.73%、13.95%。無成膜能力組的耐藥表型也主要分布在5～10耐之間,占84.62%,除了9耐和10耐占的比例比較大(分別為21.54%和23.08%)外,其余幾個耐表型菌低于15.0%。

圖1 249株不同成膜能力大腸埃希菌耐藥譜分布規(guī)律Fig.1 Drug-resistance spectrum of 249 E.coli strains in different biofilm-forming ability

2.2 大腸埃希菌臨床分離株ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析

64株臨床分離大腸埃希菌PCR產(chǎn)物15 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖2),利用UVI Photo MW軟件包對ERIC-PCR的電泳圖譜進行處理,圖譜中每一條帶(DNA片段)均作為一個分子標記,并代表一個結合位點,根據(jù)各條帶對應的峰圖進行相關參數(shù)(峰體積,峰高度和峰面積)的比較。然后根據(jù)各分子標記的遷移速率,將同一水平線上,即同一分子質(zhì)量大小,有帶的樣品讀為“1”,無帶或者條帶模糊且很淡的樣品讀為“0”。所得的位點按分子質(zhì)量從大到小排列。讀出并記錄3條以上不同的帶,將讀出來的帶(用0和1來表示)轉換成Excel表格文件,制成0～1表之后,轉換為純文本文件用于數(shù)據(jù)處理。

圖2 ERIC-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ERIC-PCR products

應用NTSYS pc2.1軟件對64株臨床分離大腸埃希菌ERIC-PCR指紋圖譜進行分析,得到大腸埃希菌指紋圖譜的Jaccard's遺傳相似性系數(shù)矩陣,結果以非加權算術平均數(shù)配對進行聚類分析,自動生成相似系數(shù)和樹狀圖。

64株大腸埃希菌的聚類分析分為A,B,C和D 4個型,從表1可以看出,不同成膜能力在各個型中均有分布,而中等成膜能力組主要分布在A和C型,成膜能力弱的組主要分布在B、C和D,無成膜能力組的菌株則主要分布在D型。ERIC-PCR基因分型技術能夠實現(xiàn)從表型和基因水平探究大腸埃希菌菌株生物被膜的形成機理,并提供可靠的理論依據(jù),對大腸埃希菌的流行病學研究和生物被膜感染防治藥物的篩選具有一定的實際意義。

表1 臨床分離株大腸埃希菌生物被膜表型和ERIC-PCR基因分型關系Table 1 Relationship between E.coli biofilm phenotype and ERIC-PCR genotype

3 討論

3.1 耐藥譜型與生物被膜表型的關系

分析耐藥譜型和生物被膜表型之間的關系,有助于闡述在形成生物被膜的過程中,抗菌藥物和生物被膜形成能力之間相互作用,為進一步探討生物被膜形成對抗菌藥物的耐藥機制奠定基礎。本研究結果表明,在臨床分離的249株大腸埃希菌中,不同成膜能力表型的大腸埃希菌對實驗中常用抗菌藥物的耐藥譜型主要集中在5～10耐之間,耐藥譜型的多樣性是造成生物被膜能力差異的主要原因,且在耐藥譜型中耐藥抗菌藥物種類過多和過少對生物被膜的表型能力的影響不顯著。

3.2 ERIC-PCR基因指紋圖譜分析與成膜能力表型關系研究

本研究通過優(yōu)化反應條件對64株臨床分離的大腸埃希菌進行ERIC-PCR分析并建立基因指紋圖譜,對不同生物被膜表型大腸埃希菌臨床菌株進行分型,在表型水平和基因水平證實大腸埃希菌生物被膜表型與其基因型關系密切:64株大腸埃希菌臨床菌株分為A、B、C、D 4個基因型且生物被膜形成能力較中等和弱的菌株大都屬于B型和C型,而不能形成被膜的菌株大都屬于D型,與Casarez和Wei等的研究結果相近。

3.3 ERIC-PCR分型技術探討

相關文獻報道利用ERIC-PCR對腸桿菌科進行分型研究,擴增引物的選擇存在兩種模式:即單引物擴增[12-13]和雙引物擴增[14-15]。Yang W Q等[17]在對銅綠假單胞菌進行分型時采用ERIC-PCR單引物進行擴增,這可能是隨機擴增的原理,其擴增的片段大小分布在100 bp～2 500 bp之間。而我們的研究中采用雙引物進行擴增,結果擴增的條帶基本和Yang W Q的報道一致,擴增引物選擇的具體目的和優(yōu)缺點還有待進一步研究和分析。

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