王鐵峰,毛 冉,趙雪峰,錢愛東*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春130118)

分支桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)復(fù)合群和麻風(fēng)分支桿菌(M.leprae)外,統(tǒng)稱為非結(jié)核分支桿菌(Nontuberculous mycobacteria,NTM)[1-3]。目前對結(jié)核分支桿菌已經(jīng)開展了深入的研究,但結(jié)核病仍是發(fā)展中國家主要發(fā)生的疾病之一。在我國各單項疾病調(diào)查中,結(jié)核病仍為首位死亡因素[4],其原因之一就是由于NTM的混合感染。NTM廣泛存在于環(huán)境中[5],部分NTM對于人類和動物是條件性致病菌,能引起機(jī)體的多種組織病變[6-7],其中肺部的類結(jié)核樣病變,常常引起結(jié)核病的誤診,而NTM對抗結(jié)核藥物又大都具有耐藥性,所以由NTM引起的結(jié)核病的誤診,給人類和易感動物健康造成威脅[8-9],對畜牧業(yè)的發(fā)展帶來危害。然而,目前NTM的基礎(chǔ)研究狀況與其疫情極不相稱,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他疾病,尤其在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等方面。為此,本試驗針對NTM中的致病菌即偶發(fā)分支桿菌(Mycobacterium fortuitum)構(gòu)建基因組文庫,可為實驗室以后對NTM抗原及其他特征性基因的研究提供了實驗素材,也可為針對NTM提出預(yù)防和免疫措施的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從吉林省長春市某肉牛養(yǎng)殖場宰殺的牛淋巴結(jié)上分離出一株NTM,經(jīng)生化方法和分子生物學(xué)方法鑒定為偶發(fā)分支桿菌(M.fortuitum)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Sau 3AⅠ、Bam HⅠ、去磷酸化酶FastAP、T4 DNA連接酶均為Fermentas公司產(chǎn)品,pUC18載體及其通用引物BcaBEST Primer RV-M和BcaBEST Primer M13-47為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品,Taq酶、質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為天根試劑公司產(chǎn)品,其他常用生化試劑均為北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA的提取 用改良羅杰氏培養(yǎng)基于37℃擴(kuò)增培養(yǎng)偶發(fā)分支桿菌(M.fortuitum),刮取整管細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至12 mL TE溶液中,80℃水浴滅活30 min。加入溶菌酶至終濃度2 mg/mL,置于37℃作用2 h,期間不定時輕輕搖勻,以利于完全反應(yīng),加入蛋白酶K至終濃度50 μ g/mL和100 g/L SDS至終濃度10 g/L,60℃作用2 h,期間不定時輕輕搖勻。將實驗用吸液頭無菌去尖,減少抽吸時對染色體DNA的機(jī)械損傷,用酚/氯仿/異戊醇(體積比25∶24∶1)抽提2次,直至分液相處見不到沉淀,每次離心后短時間靜置使氣泡散去至上清澄清后吸取上清,再用氯仿/異戊醇(體積比24∶1)和氯仿各抽提一次,將上清移至小燒杯中,倒入2倍體積冷無水乙醇和1/10體積的3 mol/L NaAc,肉眼可見有絮狀物析出,用玻璃棒挑取絮狀物于離心管中,700 mL/L乙醇漂洗2次,每次6 000 r/min離心5 min,倒出上清,可見管底有白色沉淀,涼干乙醇,用蒸餾水室溫溶解過夜,測OD值后于—20℃低溫保存。

1.2.2 基因組DNA的最佳酶切反應(yīng)條件的確定基因組DNA上有很多Sau 3AⅠ酶切位點,應(yīng)用Sau 3AⅠ限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行部分酶切,可以將基因組DNA隨機(jī)地酶切至一定長度范圍內(nèi)的DNA片段,所得DNA片段長度范圍是靠調(diào)整內(nèi)切酶在酶切體系中濃度的方法來控制的,酶切預(yù)試驗中取Buffer緩沖液38.8 μ L,基因組DNA 197.5 μ g,加無菌蒸餾水補充體系至368 μ L,混勻后分裝至16管0.2 mL離心管中,其中第一管加入38 μ L,其余各管均加入20 μ L,取2 μ L Sau 3AⅠ內(nèi)切酶(10 U/μ L),加入第1管中充分混勻后,從第1管中抽取20μ L加入第2管充分混勻做倍比稀釋,以此類推倍比稀釋至第16管,將16管酶切體系置于37℃水浴中1 h,65℃滅活內(nèi)切酶10 min,5 g/L瓊脂糖凝膠電泳,確定最佳酶切條件。

1.2.3 基因組DNA的部分酶切與回收 按照確定的最佳條件,取DNA 122 μ g進(jìn)行部分酶切,電泳檢測部分酶切效果后,凝膠回收1 kb～7 kb長度范圍的DNA片段。

1.2.4 載體DNA的擴(kuò)增 取pUC18環(huán)狀載體0.25 μ g加入感受態(tài)DH5α細(xì)胞中混勻,冰浴30 min,42℃熱激90 s,冰浴5 min,加入500 μ L LB培養(yǎng)液,37℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)50 min,取50 μ L涂布于LB瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過夜,挑取白色單個菌落置于15 mL LB培養(yǎng)液中,37℃搖床120 r/min振蕩培養(yǎng)10 h,離心收集菌體進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取,電泳檢測載體質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.5 載體DNA的酶切和去磷酸化 酶切反應(yīng)體系為BamHⅠ5 μ L(10 U/μ L),載體DNA 5 μ g,buffer10 μ L,加水補至100 μ L,37℃水浴2 h,75℃水浴滅活10 min。

線性載體DNA去磷酸化反應(yīng)體系為線性載體DNA 100 μ L,去磷酸化酶2 μ L,buffer 5 μ L,37℃水浴10 min,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測載體的酶切結(jié)果。

1.2.6 連接及轉(zhuǎn)化 將已去磷酸化的線性載體pUC18(80 ng/μ L)與酶切回收的基因組DNA(200 ng/μ L)做體積比梯度混合,加T4連接酶至終濃度0.25 U/μ L,T4連接酶buffer 2 μ L,加雙餾水補充體系至20 μ L,22℃連接過夜,取10 μ L連接產(chǎn)物加入到100μ LDH 5α中,混勻后冰浴30min,42℃熱激90 s,冰浴5 min,加5倍體積LB培養(yǎng)液,37℃搖床120 r/min振蕩培養(yǎng)50 min,涂布于含有AMP(0.1 mg/mL)、X-gal(20 g/L)和IPTG(200 g/L)的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)10 h,置于4℃0.5 h充分顯色,挑取粟狀白色菌落,用pUC18載體通用引物進(jìn)行PCR檢測,反應(yīng)條件為94℃5 min預(yù)變性;94℃30 s,52℃30 s,72℃50 s,共30個循環(huán);72℃10 min延伸.10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測連接效果。

2 結(jié)果

2.1 偶發(fā)分支桿菌染色體DNA純度

測量酚氯仿抽提法提取的偶發(fā)分支桿菌染色體DNA純度,稀釋1 500倍測OD260為0.008 1,含量為0.607 5 μ g/μ L,OD260/OD280=1.81,電泳檢測其分子質(zhì)量在10 kb以上,說明DNA純度較高(圖1)。

圖1 偶發(fā)分支桿菌染色體DNAFig.1 The DNA ofM.fortuitum

2.2 基因組DNA酶切條件的確定及回收結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖電泳結(jié)果得知當(dāng)酶與DNA比例為0.015 U/μ g時,37℃水浴1 h,65℃滅活10 min后所得DNA片段較為合適,大部分集中在1 kb～7 kb之間,使用DNA回收試劑盒切膠回收1 kb～7 kb大小的DNA片段(圖2)。

2.3 酶切與去磷酸化結(jié)果

克隆擴(kuò)增的pUC18載體,質(zhì)粒提取檢測與原載體大小相同,經(jīng)過酶切、去磷化處理,電泳結(jié)果也與線性載體相同(圖3)。

2.4 線性載體DNA與外源DNA片段的連接

在線性載體DNA與外源DNA片段體積比為1∶2時連接效率最高,當(dāng)比例接近1∶5時,連接效率較低。

2.5 陽性克隆的結(jié)果

應(yīng)用pUC18載體通用引物進(jìn)行菌落PCR,電泳結(jié)果顯示含有重組DNA片段的陽性結(jié)果均在1 kb～7 kb之間,陽性結(jié)果接近100%(圖4)。

圖2 DNA酶切條件Fig.2 The DNA digesting condition

圖3 酶切載體與外源DNA片段Fig.3 The digested vector and DNA fragments

圖4 陽性菌株P(guān)CR和部分陽性菌株小提質(zhì)粒Fig.4 The results of PCR and plasmids of positive strain

2.6 基因組文庫的構(gòu)建

根據(jù)公式N=ln(1-P)/ln[1-(I/G)](其中N為轉(zhuǎn)化子數(shù),P為獲得目的基因的可能性,一般為99%,I為克隆片段的平均大小,G為基因組大小,偶發(fā)分支桿菌基因組大小約為4×106bp),獲得目的基因的可能性為99%時,所需的基因文庫的克隆數(shù)量為2 629個～18 418個,共計獲得陽性克隆大約4×104個,達(dá)到基因組文庫要求。

3 討論

3.1 基因組DNA的提取

由于分支桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊,完整的高純度的提取其基因組DNA存在一定困難[10],試驗中經(jīng)過多次嘗試改進(jìn),將真核細(xì)胞核酸提取與原核細(xì)胞核酸提取方法結(jié)合,當(dāng)無水乙醇沉淀核酸時,用玻璃棒挑取絮狀核酸,這樣可以將核酸DNA與乙醇中散在懸浮的蛋白分開,再用700 mL/L乙醇沖洗核酸,蒸餾水溶解核酸。此改進(jìn)方法提取的分支桿菌核酸,溶解性好,OD260/OD280高達(dá)1.8左右,可以用于基因文庫的構(gòu)建。

3.2 基因組DNA酶切片段的回收

回收指定大小基因組DNA片段的方法主要有蔗糖梯度超離心法和透析袋法[11-12],較少用到瓊脂糖凝膠電泳回收法,原因是該方法回收的片段長度有限,且回收效率較低,本試驗通過改變DNA在吸附柱中的吸附時間、重復(fù)多次用一份去離子水洗脫的方法,提高DNA片段的回收效率,同時注意操作過程中吸液頭去尖,最大限度的減小大片段DNA的斷裂,經(jīng)過改進(jìn)的回收方法操作簡便,不需要高成本的大型實驗器材,短時間內(nèi)就能獲得高質(zhì)量高純度的DNA片段,降低了實驗難度,加快了實驗進(jìn)程,也可以為同類需要獲得大片段核酸的實驗所借鑒。

3.3 線性載體與外源DNA的連接

連接反應(yīng)中,小片段DNA的連接效率要高于大片段DNA,為了提高大片段DNA的連接效率,使基因組文庫含蓋率增加,試驗中設(shè)置了線性載體與外源DNA連接反應(yīng)比例梯度,最后證實,當(dāng)載體與外源DNA體積比達(dá)到1∶2時,連接所得重組子最多,其中大片段DNA與小片段DNA連接效率最為接近,而當(dāng)比例小于1∶2時,陰性克隆增加,當(dāng)比例大于1∶2時,連接反應(yīng)效率降低,所得陰、陽性克隆均明顯減少。

3.4 陽性克隆的篩選

選用菌落PCR檢測陽性克隆結(jié)果,試驗操作簡便、快捷,所需成本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于酶切鑒定試驗。通過瓊脂糖電泳檢測,結(jié)果較為滿意,所以PCR方法對基因組文庫鑒別是首選方法。

3.5 基因組文庫的保存

基因組文庫的保存常常選用刮取所有克隆于超低溫保存,也有選擇96孔細(xì)胞培養(yǎng)板對每個克隆獨自保存的,本試驗采用前一種方法,但是這些保存方式對溫度條件要求嚴(yán)格,處于液態(tài)的基因文庫體積較大,不利于文庫的交流使用,所以本實驗?zāi)壳罢趪L試對所建文庫采用真空冷凍干燥技術(shù)保存,已經(jīng)進(jìn)行長期保存和定期復(fù)蘇檢驗階段,現(xiàn)在還沒有將該技術(shù)用于基因組文庫菌種保存的實驗報道,此技術(shù)保存文庫菌種成功后,將克服溫度控制、保存體積等方面的缺點,更有利于基因文庫的長期穩(wěn)定保存和交流使用。

3.5 基因組文庫的意義及發(fā)展

自從20世紀(jì)70年代Clarke J E等[13]提出基因組文庫的概念以來,隨著越來越多高效穩(wěn)定的載體的構(gòu)建,越來越多的生物基因被用基因組文庫的方式保存起來,這種離體保存生物基因的技術(shù)可使生物基因長期穩(wěn)定的得以保存,并為各科研機(jī)構(gòu)的交流提供方便,同時也大大加快了科研進(jìn)程,其做為一種遺傳和分子生物學(xué)研究手段也更多的應(yīng)用于人類基因的研究工作。Young R A等[14]和ClarK-Curtiss J E等[13]分別構(gòu)建結(jié)核分支桿菌和麻風(fēng)分支桿菌基因庫以來,越來越多的基因組文庫被用來研究結(jié)核分支桿菌,而對于NTM的研究目前還沒有建立基因組文庫的報道,所以本試驗就NTM中致病性菌株偶發(fā)分支桿菌建立了基因組文庫,所含克隆數(shù)足以覆蓋偶發(fā)分支桿菌的全部基因,該文庫的建立為以后對該菌致病基因、耐藥基因、抗原有關(guān)基因等方面的研究及基因結(jié)構(gòu)和調(diào)控等研究打下良好基礎(chǔ)[15-16],同時也為其他NTM的研究工作奠定了一定的技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

[1] Wallace Jr R J,Cook J L,Glassroth J,et al.American Tho racic Society statement:diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria[J].Am J Respir Crit Care Med,1997,156:S1-S25.

[2] Griffith D E,Aksamit T,Brown-Elliott B A,et al.An official A TS/IDSA statement:diagnosis,treatment,and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175:367-416.

[3] Field S K,Cowie R L.Lung disease due to the more common nontuberculous mycobacteria[J].Chest,2006,129:1653-1672.

[4] 孫泉云,王根龍,陳 琦,等.野生動物結(jié)核病研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(8):93-97.

[5] 楊建華,馬麗萍.非結(jié)核分支桿菌感染現(xiàn)狀和治療的探討[J].醫(yī)藥論壇雜志,2004,25(17):3-4.

[6] 劉 相,陳海峰,杜月菊,等.分支桿菌不同菌型的耐藥結(jié)果分析[J].河北醫(yī)藥,2007,29(12):1395-1396.

[7] 劉 相,陳海峰,魏喜玲,等.結(jié)核分支桿菌耐藥結(jié)果分析[J].河北醫(yī)藥,2010,32(15):2112-2113.

[8] Michelarakis J,Varouhaki C.Osteomyelitis of the calcaneus due to atypical Mycobacterium[J].Foot and Ankle Surgery,2009,15:106-108.

[9] Alagarswamy R K,Halfpenny W,Thiruchelvam J K,et al.Rare presentation of Mycobacterium avium-intracellulare infection[J].Brit J Oral Max Surg,2007,45:670-672.

[10] 王海軍,陳 迪,王春雨,等.分支桿菌DNA的不同提取方法在PCR反應(yīng)中的定性評價[J].經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報,2010,14(2):107-112.

[11] 蔡 宏,陳 東,李淑霞,等.牛結(jié)核分支桿菌基因文庫的構(gòu)建[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,1999,21(2):114-116.

[12] 桓明輝,陳 飛,吳紅艷,等.不吸水鏈霉菌基因文庫的構(gòu)建及初步篩選[J].生物技術(shù)通報,2009(1):134-137.

[13] Clark-curtiss J E,Jacobs W R,Docherty M A,et al.Molecular analysis of DNA and construction of genomic libraries of M.leprae[J].J Bacterio,1985,1(161):1093.

[14] Young R A,Bloom B R,Grosskinsky C M,et al.Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA[J].Proc Natl Acad SciUSA,1985,82:2583.

[15] 林祥梅,薛 梅,韓雪清.牛分支桿菌主要保護(hù)性抗原研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(6):86-90.

[16] 嚴(yán)懿嘉,朱建國,劉 芳,等.分支桿菌分泌蛋白研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(3):64-67.