鄧顯文,謝芝勛,謝麗基,劉加波,謝志勤,龐耀珊

(廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧530001)

雞傳染性貧血(Chicken infectious anemia,CIA)是由雞傳染性貧血病毒(CIAV)引起的,可引起3周齡以內(nèi)的雞嚴(yán)重貧血、出血,骨髓和淋巴器官嚴(yán)重萎縮[1]。隨著雞年齡增長(zhǎng)對(duì)CIAV的抵抗力增強(qiáng),成年雞感染后不出現(xiàn)任何臨床癥狀,但種雞可將CIAV垂直傳播給其子代,引起子代發(fā)生傳染性貧血;臨床上CIAV感染雞群常伴發(fā)或繼發(fā)其他疾病,甚至引起疫苗免疫失敗等。近幾年的流行病學(xué)調(diào)查表明,CAIV在我國(guó)雞群中的感染非常普遍,感染率高達(dá)40%～96%[2-3],導(dǎo)致了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

CAIV可在雞群中長(zhǎng)期存在,引起免疫抑制,常導(dǎo)致疫苗免疫失敗,加大了對(duì)該病預(yù)防和控制的困難。為了解CIAV廣西野毒株的變異情況,本研究對(duì)1株廣西分離株進(jìn)行全基因擴(kuò)增、克隆及測(cè)序,并與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的31株CIAV全基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析,為廣西CIAV的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源與處理 CIAV(GXC060821)株由廣西獸醫(yī)研究所分離自某公司38日齡的三黃雞。免疫接種新城疫疫苗7 d后發(fā)病,雞群羽毛粗亂,精神沉郁,雞冠、肉垂略顯蒼白,而死亡雞的小腿骨骨髓呈淡黃色。無(wú)菌操作取死亡雞的胸腺、骨髓、肝、脾等組織,置—30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 大腸埃希菌DH5α由廣西獸醫(yī)研究所獸醫(yī)分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存;克隆載體pMD18-T PCR試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;LB培養(yǎng)基和凝膠回收試劑盒為GIBCO公司產(chǎn)品;氨芐青霉素為Promega公司產(chǎn)品;100 bp DNA ladder為北京天為時(shí)代科技有限公司產(chǎn)品;PCR儀為美國(guó)Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600型。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 無(wú)菌采取2 g可疑傳染性貧血病待檢雞的胸腺、骨髓、肝、脾等組織,置于乳缽或玻璃研磨器中,加入無(wú)菌的PBS充分研磨,收集組織懸液于1.5 mL離心管,凍溶3次,以2 500 r/min離心5 min,收集上清液650 μ L,供CIAV總DNA抽提。

1.2.2 病毒分離鑒定 將經(jīng)參考謝芝勛建立的CIAV-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定[4]為陽(yáng)性的病雞骨髓懸液,分別用氯仿和乙醚處理,除去可能存在的其他囊膜病毒后卵黃囊接種7日齡SPF雞胚,取部分剛出殼雛雞的骨髓和脾臟的懸液作為種毒[5]置—70℃保存?zhèn)溆?另取適量?jī)鋈?次后取上清供CIAV總DNA抽提,用PCR檢測(cè)證實(shí)含有CIAV。

1.2.3 核酸抽提 參照酚:氯仿法抽提其DNA[4、6],保存于—20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增 根據(jù)已發(fā)表的CIAV基因(No.AF311900),設(shè)計(jì)3對(duì)PCR引物(表1)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,用TE buffer配成適當(dāng)濃度,貯存于—20℃?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系100 μ L:3 μ L 8 mmol/L MgCl2,4 μ L 2.5 mmol/L dNTP,10 μ L 10×PCR緩沖液,300 ng上游引物和下游引物,0.5 μ L(2.5 U)Taq DNA聚合酶,DNA模板4 μ L,用滅菌ddH2O加至總體積為100 μ L。首先94℃5 min;然后94℃1 min,57.5℃退火1 min,72℃1 min的循環(huán),循環(huán)35次;最后72℃10 min結(jié)束,4℃終止反應(yīng)。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.2.5 基因的克隆 用凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。取適量純化回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體于16℃連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。挑取在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的白色菌落,37℃培養(yǎng),用堿裂解法抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR快速鑒定[6],陽(yáng)性克隆菌送大連寶生生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 序列分析 用DNA Star軟件將CIAV廣西株全基因組與其它全基因序列進(jìn)行同源性比較。同時(shí)對(duì)廣西分離株基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

用CIAV廣西分離株抽提的DNA為模板,引物XZCIAV21、XZCIAV22可擴(kuò)增出約931 bp的片段,引物XZCIAV23、XZCIAV24可擴(kuò)增出約870 bp的片段,引物XZCIAV15、XZCIAV16可擴(kuò)增出約1 091 bp的片段,擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

2.2 克隆與鑒定

CIAV廣西株的PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體連接后,轉(zhuǎn)化到DH5α大腸埃希菌,經(jīng)過(guò)PCR快速鑒定及測(cè)序結(jié)果表明,克隆的陽(yáng)性重組質(zhì)粒均帶有相應(yīng)菌株的基因。

2.3 同源性比較

將CIAV廣西株的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與基因文庫(kù)中America(L14767)[7],Australia(U65414,Unpublished),Gemany(M 81223)[8],Japan(E51057,Unpublished)、Malaysia(AY040632)[9]、Tianjin(AY846844,Unpublished)、ChimrHarbin(AF475908)[10],Taian(EF176599)[11]等31株CIAV全基因序列進(jìn)行同源性比較,結(jié)果顯示,核苷酸同源性為96.1%～98.5%;氨基酸的同源性為89.8%～94.2%,也具有較高的同源性。

圖1 雞傳染性貧血病毒PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products of CIAV

2.4 基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

為分析廣西分離株與其他毒株在遺傳進(jìn)化關(guān)系上的距離,把廣西分離株與國(guó)內(nèi)外31株CIAV毒株一起構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖2)。廣西分離株與中國(guó)的TJBD40株(NO.AY846844)、LF4株(NO.AY839944)的親緣關(guān)系較近,而與美國(guó)的98D06073分離株(NO.AF311900)及中國(guó)的HA4分離株(NO.DQ124934)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 GXC060821毒株全基因遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of gene of GXC060821 strains

3 討論

CIAV屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae),為無(wú)囊膜的20面體的小病毒,直徑只有20 nm左右;CIAV的基因組是一條只有2.3 kb單股環(huán)狀DNA[1],只產(chǎn)生一個(gè)轉(zhuǎn)錄子,可編碼3個(gè)蛋白質(zhì),即衣殼蛋白VP1及其相關(guān)蛋白VP2,細(xì)胞凋亡因子VP3[12]。CIAV的致病性在于通過(guò)CAIV編碼產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡基因造成的細(xì)胞程序性死亡[5],主要是造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的程序性死亡,進(jìn)而造成感染雞的貧血,出血及免疫抑制;何成強(qiáng)等[10]和李延鵬等[5]己報(bào)道對(duì)幾株CAV野毒株完成了全基因組序列的測(cè)定,但末見(jiàn)廣西CAIV野毒株全基因組序列的測(cè)定的報(bào)道,為了解廣西野毒株的變異情況,我們利用PCR技術(shù)對(duì)1株廣西分離株進(jìn)行全基因擴(kuò)增、克隆及測(cè)序,并進(jìn)行比較分析,為雞場(chǎng)防控和凈化該病提供技術(shù)支持。

利用PCR方法擴(kuò)增出GXC060821分離株基因組內(nèi)的3條片段。將各段PCR產(chǎn)物分別克隆于T載體中并測(cè)序,拼接獲得GXC200601分離株的全基因序列。分析表明GXC060821分離株CAV基因組全長(zhǎng)2 292 bp,含有3個(gè)互相重疊的開(kāi)放閱讀框,分別編碼VP1(1 350 bp)VP2(651 bp)和VP3(366 bp)。我們比較了廣西分離株病毒與基因文庫(kù)中31株VP1,VP2和VP3基因所編碼的氨基酸序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn),廣西分離株與基因文庫(kù)中31株VP1、VP2、VP3基因核苷酸同源性分別為94.4%～98.6%、98.6%～99.5%、98.6%～99.7%,氨基酸的同源性為96.7%～99.6%、96.8%～98.6%、96.7%～99.2%。廣西分離株VP2氨基酸序列和中國(guó)的AH4、SD24、TJBD40、SH11等10株只有1個(gè)氨基酸差異,與美國(guó)的Cux-1株只有2個(gè)氨基酸差異;廣西分離株VP3氨基酸序列和中國(guó)的HN9、SD24、TJBD40、SH11等10株、美國(guó)的98D06073等國(guó)外5株沒(méi)有差異,與美國(guó)的Cux-1株只有2個(gè)氨基酸差異;廣西分離株VP1氨基酸序列和中國(guó)的TJBD40株只有1個(gè)氨基酸差異,SH16有2個(gè)氨基酸差異、TJBD33、SD22、HN9有3個(gè)氨基酸差異,與其他參考株的氨基酸差異比較大,這是因?yàn)閂P1是CAV的衣殼蛋白組成成分,也是抗原蛋白基因,它的變異可能與宿主免疫反應(yīng)的選擇壓有關(guān)。

CAIV全基因序列同源性比較結(jié)果表明,廣西分離株與基因文庫(kù)中31株全基因核苷酸同源性為96.1%～98.5%;氨基酸的同源性為89.8%～94.2%,也具有很高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析顯示,廣西分離株和中國(guó)天津TJBD40株、LF4株都處于一個(gè)分支,它們的親緣關(guān)系較近,而與美國(guó)的98D06073分離株及中國(guó)天津的HA4分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

綜上分析可知,CIAV廣西分離株與國(guó)內(nèi)的TJBD40、SH16、TJBD33、SD22、HN9等參考株比較,氨基酸序列沒(méi)有引起大的變異,只是VP1的氨基酸差異比較大些,但這些氨基酸差異并沒(méi)有引起質(zhì)的變異,這些分析結(jié)果為廣西雞傳染性貧血滅活苗的研制及基因工程亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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