吳劉成,劉 春,蔣熒梅,王生存,邵義祥,*

(1.南通大學(xué)實驗動物中心,江蘇南通226001;2.南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所,江蘇南通226001)

小鼠在正常發(fā)育過程中,胚胎期約在第11天開始出現(xiàn)原始的眼瞼即單層細(xì)胞上皮,第12～17天,這層上皮細(xì)胞迅速發(fā)育分化形成復(fù)層上皮細(xì)胞,并出現(xiàn)角質(zhì)化,在第14～16天之間眼瞼不斷生長發(fā)育覆蓋了角膜,眼瞼上緣和下緣融合,完成胚胎期眼瞼閉合,出生后14 d眼瞼重新開放[1]。眼瞼開裂(Gaping lids gp)小鼠最早在1961年發(fā)現(xiàn)[2],由C57BL/6-ax品系的小鼠自發(fā)產(chǎn)生的常染色體隱性遺傳突變模型,外顯率100%,或者被稱為lidgap-Gates(lg-Ga)模型,該突變系小鼠出生時眼瞼開放,通過PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)lgGa突變系純合子小鼠Map3k1基因第2～8外顯子缺失,基因組缺失27.5 kb[3]。隨著生物技術(shù)手段的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)敲除Map3k1基因,角質(zhì)形成性細(xì)胞微絲形成異常,細(xì)胞遷移力下降[4],研究表明Map3k1表達蛋白MEKK1通過激活JNK通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及遷移,基因敲除后JNK1磷酸化水平下降,細(xì)胞遷移障礙,胚胎時期眼瞼不能夠正常融合,出生時眼瞼開放(eye open at birth,EOB)。

B6-Co(C57BL/6-Corneal opacity mouse,B6-Co)小鼠是本中心利用ENU誘變技術(shù)獲得的具有角膜混濁表型的突變系小鼠,該突變系小鼠出生時眼瞼開放,后角膜混濁[5]。蔣熒梅等利用SNP標(biāo)記將B6-Co小鼠角膜混濁突變基因精確定位于13號染色體上112 546 283 bp～113 397 654 bp之間[6],Map3k1基因即位于定位區(qū)間,提出Map3k1作為B6-Co小鼠角膜混濁強力候選突變基因,本試驗對該基因進行了克隆與序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6(B6)小鼠、B6-Co突變系小鼠由南通大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2008-0010。

1.1.2 主要儀器與試劑 冷凍離心機、PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品;電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)為江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;RT試劑盒為Fermentas(MBI)公司產(chǎn)品;TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pGEM-T Easy Vector System試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA和DNA的提取 取小鼠大腦組織50 mg～100 mg,按照Trizol試劑盒說明提取總RNA;核酸定量儀測定RNA濃度;取2 μ L～5 μ L總RNA按照RT試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。剪取小鼠尾尖1 cm,置于1.5 mL離心管;加入500 μ L消化液和蛋白酶K 6 μ L混合物,55℃水浴過夜;取過夜消化混合物,按照《分子克隆實驗指南》操作[7]。

1.2.2 PCR體外擴增目的基因 在NCBI上查找小鼠Map3k1的mRNA序列,共20個外顯子,全長6 963 bp,第1外顯子481 bp,第20外顯子2 581 bp,第2～19個外顯子以cDNA產(chǎn)物為模板擴增,第1、20個外顯子及上游調(diào)控序列以基因組為模板設(shè)計引物。將引物序列在小鼠基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST分析,確定引物的特異性。第2～20外顯子共設(shè)計8對引物:Map3k1-2 F:GGAAGACGAGTGGT TGG,R:GGCTGTAGAAGTCATGGGAT,產(chǎn)物長度918 bp;Map3k1-3 F:CGGAACACCATCCAGAAGT T T,R:CAGCATGGCTCTCAATGT TT,產(chǎn)物長度777 bp;Map3k1-4 F:TCTATAGTCTGCGCTGACCCT,R:TCAGAAATGTCCTCCGAGCT,產(chǎn)物長度857 bp;Map3k1-5 F:AGAAAACAGCTCCCT TGAGCA,R:TAAGGCTGTT TCGCTT TGGT,產(chǎn)物長度1 302 bp;Map3k1-6 F:CGATGTCAGCGTCTCAGGAT,R:AGGCGAGATGAT TGGAGTGTT,產(chǎn)物長度798 bp;Map3k1-7 F:ACTGGGAGGCTATGAGGTTC,R:GT T TATCAGCCCAGTCTCGTAT,產(chǎn)物長度1 526 bp;Map3k1-8 F:TCTCTGTCACGACCCATCAC,R:CAGTGCTAATCTGACCGAATG,產(chǎn)物長度815 bp;Map3k1-9 F:GCACTCTTGCCAT TTACCG,R:T TCT TCT TGAGT T TCCTGCG,產(chǎn)物長度864 bp。Map3k1上游約5 kb序列共設(shè)計4對引物:Map3k1-01 F:CGCCAGGTAGTGCGAGAC,R:GGCAGCTTTATCCCGT TG,產(chǎn)物長度759 bp;Map3k1-02 F:CTCCCTGGTTGCCCTGT,R:TCCT TAGCCAATCTGGTCCT,產(chǎn)物長度1 193 bp;Map3k1-03 F:TCTGCTGTCAT TATGCACCTAT,R:T TGTT TCT TTGCATGTAGGACT T,產(chǎn)物長度1 250 bp;Map3k1-04F:CACTT TCAGGCAGGGTCAG,R:GGCTGAACGCT TGGAGTC,產(chǎn)物長度1 038 bp。由于Map3k1第1外顯子GC含量高達80.2%,按常規(guī)設(shè)計引物原則不能成功擴增,必須提高引物的退火溫度:Map3k1-1.1 F:GCCCCGCTCGCT TCAT TCA,R:CCGCCCTGCCCATCTACTTCC,產(chǎn)物長度252 bp;Map3k1-1.2 F:CGGCGACGGGGAAGTAGATG,R:CGCAGGCACGAGCGAATGT,產(chǎn)物長度328 bp;這兩對引物Tm值均為63℃。

PCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer(含Mg2+)5.0 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μ L,上游引物(10 μ mol/L)2 μ L,下游引物(10 μ mol/L)2 μ L,模板DNA,2.5 ng,Ex Taq DNA poly mease(5 U/μ L)0.25 μ L,補滅菌去離子水至50 μ L。擴增條件:根據(jù)引物Tm值和擴增長度設(shè)置退火溫度、變性時間及延伸時間。第一外顯子GC含量高,需要在普通Taq酶反應(yīng)體系中添加甜菜堿才能成功擴增,終濃度至2.5 mol/L。反應(yīng)條件:94℃5 min預(yù)變性質(zhì)94℃1 min,63℃30 s,72℃30 s,共35循環(huán),72℃5 min。根據(jù)引物1.1和1.2成功擴增出目的片段。取PCR終點產(chǎn)物,凝膠電泳及成像保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆 按照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司UNIQ-10柱式膠回收試劑盒操作純化PCR產(chǎn)物;與T載體連接,4℃過夜;取5 μ L鏈接產(chǎn)物和50 μ L～100 μ L感受態(tài)細(xì)胞加入預(yù)冷的離心管中;冰浴5 min;42℃熱休克90 s;冰浴30 min;加入200 μ L LB培養(yǎng)液,37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)45 min;取120 μ L～200 μ L菌液涂于15 g/L瓊脂LB平板(添加氨芐青霉素、X-Gal和IPTG);37℃培養(yǎng)過夜;挑取白斑,擴培搖菌12 h～14 h;質(zhì)粒DNA分子提取;電泳檢測;EcoRⅠ酶切釋放目的片段,電泳檢測,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 序列分析 目的片段測序后,在小鼠基因庫中BLAST測序的序列是否與正常組小鼠基因一致。如存在堿基的突變,查看其是否位于蛋白編碼區(qū),并預(yù)測在蛋白水平上氨基酸序列可能引起的變化。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR體外擴增目的基因

為了測序的需要,PCR擴增的DNA片段都在1 500 bp以下,擴增第2到第19個外顯子時,以B6小鼠和B6-Co小鼠的cDNA為模板,在擴增第1和第20個外顯子時,以B6小鼠和B6-Co小鼠的基因組DNA為模板,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,成功擴增出了Map3k1基因的8個片段以及上游約5 kb序列(圖1和圖2),第1外顯子分段PCR結(jié)果見圖3。

圖1 Map3k1 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Map3k1 RT-PCR products electrophoresis result

圖2 Map3k1上游調(diào)控序列四段PCR產(chǎn)物電泳Fig.2 Four fragments of Map3k1 forward regulate PCR products electrophoresis

圖3 Map3k1第1外顯子分段PCR產(chǎn)物電泳 Fig.3 Fragments of Map3k1 first exon PCR product electrophoresis

2.2 質(zhì)粒DNA的抽提、鑒定及酶切分析

將挑出的白斑擴增培養(yǎng)過夜,進行質(zhì)粒提取,電泳檢測(圖4),每個泳道有3條帶,泳動速度最快的是超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒,中間的是螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒,最慢的是線型質(zhì)粒DNA。

EcoRⅠ酶切反應(yīng)結(jié)束后,凝膠電泳檢測,由于T載體上插入片段兩端有EcoRⅠ酶切位點,所以,酶切后質(zhì)粒電泳一般有兩條帶,泳動速度最快的是目的片段,最慢的是被酶切的線性化的T載體(圖5)。

2.3 測序結(jié)果分析

圖4 部分重組質(zhì)粒電泳結(jié)果Fig.4 Part of recombinant plasmid electrophoresis

圖5 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳Fig.5 Recombinant plasmid restriction enzyme digestion product electrophoresis

測序峰圖顯示,B6和B6-Co小鼠在第2外顯子PCR產(chǎn)物測序峰圖中均出現(xiàn)重疊峰,其他外顯子及上游調(diào)控序列PCR產(chǎn)物測序峰圖均沒有出現(xiàn)重疊峰,克隆測序進一步驗證該位點存在突變,與NCBI數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)B6小鼠和B6-Co小鼠Map3k1基因mRNA序列第955位,即小鼠13號染色體112 559 574堿基與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn),堿基T突變?yōu)锳,這樣編碼的第314氨基酸由亮氨酸變?yōu)楣劝彼?蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)域均發(fā)生了變化。也有可能是數(shù)據(jù)庫存在錯誤,還需要從多個實驗動物種子中心引種,對該堿基位點進行驗證。

3 討論

3.1 Map3k1的功能

Map3k1表達的蛋白MEKK1具有Ser/Thr激酶活性,可以磷酸化與其結(jié)合的蛋白,介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用并影響其行為和功能[9]。MEKK1可以被上游許多調(diào)控因子激活,如FAK、RhoGEF、RhoA、Rac、以及actinin protein等,從而活化下游相關(guān)的信號通路,因此可以和許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相聯(lián)系,可以作用于傷口的愈合以及癌細(xì)胞的侵襲等細(xì)胞遷移相關(guān)事件[10]。MEKK1在體內(nèi)高度選擇性地磷酸化MKK4,從而激活JNK,JNK/SAPK接受上游信號被激活后,可以進一步使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-jun氨基末端絲氨酸殘基磷酸化,激活c-jun而增強其轉(zhuǎn)錄活性[11]。

MEKK1是活化JNK的上游重要調(diào)控因子,MEKK1激酶結(jié)構(gòu)域敲除后JNK1磷酸化水平明顯降低,從而使該信號通路阻斷,細(xì)胞微絲骨架異常,細(xì)胞遷移受阻。MEKK1在眼瞼上皮細(xì)胞前一邊緣高水平表達,并且需要F肌動蛋白的形成。除了MEKK1還需要TGF-β/activin誘導(dǎo)肌動蛋白張力纖維的形成,從而體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞才能遷移,總之,MEKK1調(diào)節(jié)上皮層細(xì)胞運動促使眼瞼閉合[12]。

3.2 B6-Co突變系小鼠候選基因的探討

Zhang L等[4]對Map3k1激酶結(jié)構(gòu)域敲除系小鼠進行研究表明,只有純合的敲除系小鼠才表現(xiàn)為出生時眼瞼開裂,雜合突變系表現(xiàn)基本正常,為隱性致病型,雜合子存在正常的Map3k1等位基因,可以滿足Map3k1調(diào)控作用。B6-Co突變系小鼠出生時眼瞼開裂,有單眼,也有雙眼,發(fā)生率約為43.1%,為單基因顯性遺傳,但至目前也未獲得純合子,也未見胚胎致死。與單基因顯性遺傳規(guī)律還存在差異,其遺傳機制尚需深入探討。B6-Co小鼠眼瞼發(fā)育缺陷導(dǎo)致角膜發(fā)育異常和先天性眼表疾病,該小鼠角膜混濁的病理過程呈典型的炎癥反應(yīng),與人類角膜炎的病理變化過程相似[13],具有很高的開發(fā)價值。

通過克隆測序的方法能夠比較準(zhǔn)確地獲得目的基因的DNA序列,有助于正確判斷目的基因相關(guān)的分子機制[14-15]。本試驗結(jié)果表明Map3k1基因存在單堿基突變,編碼的氨基酸也發(fā)生了改變,這為進一步深入研究該基因?qū)6-Co小鼠眼瞼發(fā)育及角膜混濁形成機制奠定基礎(chǔ)。由于基因結(jié)構(gòu)及調(diào)控機制的復(fù)雜性,非編碼區(qū)對基因的功能也有重要作用,kitl1-bao純合子小鼠kitl基因非編碼區(qū)第8號內(nèi)含子第2個堿基由T轉(zhuǎn)換為C,從而引起mRNA剪接錯誤,導(dǎo)致基因功能發(fā)生了重大變化[16],所以要繼續(xù)關(guān)注該基因的內(nèi)含子、基因下游以及上游更遠端的序列。Map3k1基因也有可能產(chǎn)生表達量的變化,或表達的蛋白質(zhì)剪切加工過程中受到影響,因此,應(yīng)進一步采用熒光定量PCR技術(shù)檢測Map3k1基因的表達調(diào)控,用Western blot技術(shù)檢測MEKK1蛋白水平的變化。

同時,在13號染色體60cM附近可能存在其他突變候選基因,從而導(dǎo)致了小鼠出生時眼瞼開放的發(fā)生,也需要繼續(xù)關(guān)注小鼠13號染色體60cM附近其他基因的功能。也有研究表明位于13號染色體75cM附近的Fgf10(fibroblast growth factor 10)基因突變后也能夠產(chǎn)生相似的表型[17],雖然不在定位區(qū)間內(nèi),但遺傳距離只是相對的,值得予以關(guān)注。

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