吳苗苗,黃明明,陳友梅,李能章,王豪舉

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶400715)

病原性細(xì)菌侵入宿主并致病的過(guò)程是病原菌和宿主細(xì)胞互相作用的復(fù)雜過(guò)程,這一系列復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程需要病原菌相應(yīng)的毒力基因隨著宿主體內(nèi)環(huán)境的變化而得以表達(dá)或上調(diào)[1]。病原菌進(jìn)入宿主體內(nèi)所處的環(huán)境與體外差異極顯著[2],為適應(yīng)這種差異病原菌會(huì)自動(dòng)調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因表達(dá)模式,即上調(diào)其在宿主體內(nèi)生存起關(guān)鍵作用的基因和對(duì)侵染宿主有利的毒力基因的表達(dá),而下調(diào)無(wú)關(guān)基因的表達(dá)。這種只在進(jìn)入宿主體內(nèi)后表達(dá)而在體外無(wú)法表達(dá)的基因,稱(chēng)為體內(nèi)誘生基因(invivo induced gene)[3-5]。大量的研究表明,病原菌這種只在體內(nèi)表達(dá),而在體外不表達(dá)的獨(dú)特的基因,不僅對(duì)病原菌在宿主體內(nèi)的存活和病原菌的致病過(guò)程起到重要作用[6],而且也是良好的候選保護(hù)性抗原和理想的藥物靶標(biāo)。因此,對(duì)病原菌體內(nèi)誘生抗原的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到重視,從而發(fā)展出了一系列篩選體內(nèi)誘生抗原的方法,如體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(in vivo expression technology,IVET)、信號(hào)標(biāo)簽突變(signaturetagged mutagenesis,STM)、差異熒光誘導(dǎo)(differential fluorescence induction,DFI)、體外轉(zhuǎn)座進(jìn)行基因組分析和作圖(genomic analysis and mapping by in vitro transposition,GAM-BIT)以及體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(in vivo induced antigen technology,IVIAT)等,本文就這幾個(gè)抗原篩選技術(shù)做一綜述。

1 體內(nèi)表達(dá)技術(shù)

Slauch J M等用他們首次設(shè)計(jì)的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(IVET)[7]成功鑒定出多種鼠傷寒沙門(mén)菌的體內(nèi)誘生抗原基因。此方法的原理是啟動(dòng)子捕獲策略,即將一定大小的病原菌基因組隨機(jī)片段與無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)告基因(如lacZ、抗生素抗性基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷等)融合,并將之整合到病原菌染色體上,通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型從中選擇那些只在體內(nèi)表達(dá)融合報(bào)告基因而在體外不表達(dá)的菌株,就可以鑒定出病原菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)被誘導(dǎo)的基因。研究者根據(jù)篩選目的的不同采用不同的報(bào)告基因,又分別設(shè)計(jì)出以下6種基于IVET的篩選方法。

1.1 營(yíng)養(yǎng)缺陷型體內(nèi)表達(dá)技術(shù)

此方法的原理是將病原菌所必需的管家基因作為報(bào)告基因,其缺陷型無(wú)法在宿主體內(nèi)存活,用其報(bào)告基因的缺陷突變體為宿主,只要報(bào)告基因被激活,宿主就能存活。該方法最初是通過(guò)證明purA和thyA缺陷型無(wú)法在宿主體內(nèi)存活,鑒定出鼠傷寒沙門(mén)菌的體內(nèi)誘導(dǎo)基因。近年來(lái)有研究表明,asd或dapB基因參與二氨基庚二酸鹽的生物合成[8]。

這種方法有兩個(gè)缺點(diǎn)。首先,某些病原菌無(wú)法構(gòu)建所需的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株;其次,產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株也可能導(dǎo)致病原菌無(wú)法存活。然而,只要能產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株,并且該缺陷株無(wú)礙于病原菌的存活,營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選的IVET就可以成為篩選體內(nèi)誘生抗原的一個(gè)有力工具。

1.2 抗生素體內(nèi)表達(dá)技術(shù)

針對(duì)某些無(wú)法構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的病原菌,可以采用抗生素IVET。已有研究者用不同的抗生素耐藥基因進(jìn)行研究,如用缺乏啟動(dòng)子的四環(huán)素耐藥基因(tet)研究牙齦卟啉單孢菌侵入小鼠體內(nèi)后的毒力,使用紅霉素耐藥基因研究豬鏈球菌侵染豬體內(nèi)后的毒力,用卡那霉素的耐藥基因研究出血敗血性巴斯德菌、創(chuàng)傷弧菌[9],用氯霉素耐藥基因(cat)研究幽門(mén)螺旋桿菌、魯氏耶爾森菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希菌,等入侵動(dòng)物體后的毒力。

這種方法雖然避免了構(gòu)建突變株的障礙,但其缺點(diǎn)在于:給予宿主抗生素有可能改變宿主的體內(nèi)環(huán)境,從而對(duì)病原菌和宿主的互作產(chǎn)生影響;給藥時(shí)間、給藥濃度、給藥方式等的不同可能造成的影響大小不同。

1.3 熒光酶體內(nèi)表達(dá)技術(shù)

Hickey M J等[10]基于IVET技術(shù)設(shè)計(jì)了熒光酶體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(luciferase in vivo expression technology),用于研究重組分支桿菌報(bào)告菌株在小鼠體內(nèi)抗分支桿菌的活性。主要針對(duì)某些生長(zhǎng)緩慢和生物安全環(huán)境要求嚴(yán)格的菌株(如結(jié)核分支桿菌),進(jìn)行體內(nèi)誘生抗原的研究,該技術(shù)的應(yīng)用,可以加速那些生長(zhǎng)緩慢的病原菌的動(dòng)物模型體內(nèi)抗生素和免疫原評(píng)估的過(guò)程。

1.4 基于重組酶的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)

無(wú)論是營(yíng)養(yǎng)缺陷型IVET、抗生素IVET還是熒光酶體內(nèi)表達(dá)技術(shù),都無(wú)法分離出短暫表達(dá)或表達(dá)水平低的體內(nèi)誘生抗原。有研究者設(shè)計(jì)了基于重組酶的體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(RIVET)[11],該技術(shù)的原理是可篩選的基因融合系統(tǒng)(the screenable gene fusion system)。使用一種特定位點(diǎn)的DNA重組酶,當(dāng)存在體內(nèi)表達(dá)時(shí),這種酶就會(huì)從細(xì)菌染色體中切除一種可選擇的基因暗帶,失去這種暗帶后即可進(jìn)行篩選或體外選擇。如當(dāng)IVET的載體與病原菌染色體發(fā)生同源重組以后,若無(wú)啟動(dòng)子的tnpR上游含有體內(nèi)誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子,則tnpR將被激活,并催化染色體上tet兩側(cè)存在的res位點(diǎn)的特異性DNA序列進(jìn)行反向重組,從而使tet被永久刪除,即一旦tnpR表達(dá),就會(huì)使病原菌由四環(huán)素耐藥型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沫h(huán)素敏感型,再通過(guò)影印平板法篩選出宿主體內(nèi)分離的菌株。目前這種方法已經(jīng)用于檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhimurium)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)[12]、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)[13]、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)等病原菌感染過(guò)程中體內(nèi)轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的基因,包括那些短暫表達(dá)或表達(dá)水平低的基因。此法還可用于監(jiān)控感染過(guò)程中那些特定的基因在空間上和時(shí)間上的表達(dá)。

1.5 差異熒光誘導(dǎo)

Valdivia R H等[14]發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)菌侵入小鼠體內(nèi)后的存活和復(fù)制依賴(lài)于低的pH環(huán)境,為此,他們?cè)O(shè)計(jì)出差異熒光誘導(dǎo)(DFI)法,且用該方法成功鑒定出8個(gè)氨基酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子,并發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域的基因負(fù)責(zé)編碼細(xì)胞表面保護(hù)酶,應(yīng)力蛋白質(zhì)組和廣義外排泵。該技術(shù)的原理是捕獲啟動(dòng)子策略,即將病原菌基因組的DNA與不帶啟動(dòng)子的綠色熒光蛋白(gleen fluorescent protein,GFP)基因融合,于特定條件下(如低pH),GFP蛋白的活性將會(huì)被誘導(dǎo)的啟動(dòng)子激活并表達(dá),同時(shí)通過(guò)啟動(dòng)子的富集作用除去組成型啟動(dòng)子,從而分離出誘導(dǎo)啟動(dòng)子。該技術(shù)與熒光激發(fā)細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)結(jié)合使用,可對(duì)病原菌基因進(jìn)行半自動(dòng)高通量的篩選。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonias)是第一個(gè)用DFI分離出毒力基因的革蘭陽(yáng)性菌。Wilson等采用與Valdivia和Falkow類(lèi)似的篩選方法分離出了單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的毒力基因(actA)。目前,DFI技術(shù)已用于篩選大腸埃希菌K1、肺炎鏈球菌、結(jié)核分支桿菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、麻風(fēng)分支桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌的體內(nèi)誘生基因。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于可進(jìn)行高通量半自動(dòng)篩選,既可分離在體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的毒力基因,也可分離在體外誘導(dǎo)表達(dá)的毒力基因,GFP的表達(dá)并不影響細(xì)菌的毒力,鑒定差異表達(dá)基因而不考慮基因的本底表達(dá)水平,同時(shí)篩選的敏感度也可通過(guò)改變熒光的閾值進(jìn)行調(diào)節(jié),重復(fù)性很高,綠色熒光使得基因表達(dá)的過(guò)程變得可以用肉眼觀察。但是,GFP的使用依賴(lài)于低的pH環(huán)境,熒光團(tuán)在有氧氣存在時(shí)才會(huì)產(chǎn)生,而目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GFP信號(hào)放大的方法或器具,熒光表達(dá)的強(qiáng)度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響,同時(shí)從感染組織器官分離的病原菌可能存在背景熒光顆粒,會(huì)對(duì)細(xì)菌分選和熒光的定量造成不同程度的影響。

1.6 系統(tǒng)特定階段誘生抗原的篩選技術(shù)

此法是將IVET設(shè)計(jì)為啟動(dòng)子誘捕基因編碼某種互作必需因子(病原菌與宿主在特定階段相互作用必需的因子),從而篩選出病原菌和宿主發(fā)生相互作用后,在特定階段誘導(dǎo)表達(dá)的基因。目前已有研究將此法用于分離根瘤菌與苜蓿共生時(shí)早期誘生的基因(bacA,gusA)[15]。

2 信號(hào)標(biāo)簽突變

Hensel M等[16]用感染鼠傷寒沙門(mén)菌(S.typhimurium)的小鼠作為模型,設(shè)計(jì)出信號(hào)標(biāo)簽突變(STM),并以此法鑒定出該菌新的致病基因,其原理是若在與病原菌侵染宿主致病過(guò)程有關(guān)的毒力基因中插入轉(zhuǎn)座子,則產(chǎn)生的突變體會(huì)因?yàn)槎玖虻牟迦攵セ钚?無(wú)法引發(fā)持續(xù)性感染,最終無(wú)法在宿主體內(nèi)存活。STM技術(shù)就是先通過(guò)突變體文庫(kù)感染宿主,而后對(duì)存活的突變體進(jìn)行負(fù)篩選即可鑒定出病原菌相關(guān)的毒力基因。目前,STM技術(shù)已用于30種以上的病原菌,篩選出了大量的轉(zhuǎn)座插入突變體,并鑒定出1 700多種病原菌的基因(包括毒力基因)。

此法的優(yōu)點(diǎn)在于可在體內(nèi)對(duì)毒力基因進(jìn)行鑒定,對(duì)致病過(guò)程而言,在體內(nèi)的研究鑒定方法比體外的方法能夠更真實(shí)的反應(yīng)病原菌與宿主之間的相互作用。此法可對(duì)突變體文庫(kù)進(jìn)行負(fù)篩選,即該檢測(cè)能夠在毒力作用減弱甚至丟失的系統(tǒng)中進(jìn)行,可進(jìn)行高通量篩選。但是此法也存在以下缺點(diǎn),STM技術(shù)依賴(lài)于混合菌體在宿主體內(nèi)的增殖能力,當(dāng)突變體不能被同一接種物中其他病原菌反式互補(bǔ)時(shí),才可對(duì)病原菌的毒力進(jìn)行鑒定;同時(shí)該技術(shù)必須以患病的動(dòng)物模型為篩選體系,人為構(gòu)建的動(dòng)物模型,不能真實(shí)地再現(xiàn)病原體與原宿主之間相互作用的所有特征,而有些病原菌引發(fā)的疾病需要建立不同的動(dòng)物模型。有些模型會(huì)繞過(guò)疾病的特定階段,而無(wú)法鑒定到被繞過(guò)階段的毒力因子。

3 體外轉(zhuǎn)座進(jìn)行基因組分析和作圖

Akerley B J等[17]提出體外轉(zhuǎn)座進(jìn)行基因組分析和作圖(GAM-BIT),并用該方法檢測(cè)了流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌的某些已知功能的必需基因和一些未知功能的開(kāi)放閱讀框(ORF)。此法原理與STM相同,也是一種負(fù)選擇的方法。此法中,對(duì)一段由PCR擴(kuò)增出來(lái)的病原染色體上的特異區(qū)域進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)突變,收集所有突變的DNA并將其導(dǎo)入病原菌中,令其在選擇性條件中(宿主體內(nèi))生長(zhǎng),然后用在這段染色體特異區(qū)域上的引物與轉(zhuǎn)座子特異的引物組成引物對(duì),最后對(duì)選擇后存活的病原菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。由于在基本基因中插入了轉(zhuǎn)座子的病原菌無(wú)法存活,所以缺少基因組上基本基因?qū)?yīng)部位的PCR產(chǎn)物,故而在PCR電泳結(jié)果圖譜中即可定位基因組上的基本基因。此法的優(yōu)點(diǎn)在于可以在那些比體外豐富的培養(yǎng)基環(huán)境嚴(yán)格得多的環(huán)境中(如宿主體內(nèi)的環(huán)境)鑒定病原菌生長(zhǎng)存活的必需基因。近年來(lái),該方法已成功用于流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和釀酒酵母菌等病原菌的基本基因的鑒別[17-18]。此法最大的優(yōu)點(diǎn)在于雖然是應(yīng)用在基因組水平的分析,但其仍然可以針對(duì)研究者感興趣的某段染色體區(qū)域或特定的DNA元件進(jìn)行操作(如毒力島、噬菌體等),但這種方法也需要建立相應(yīng)的動(dòng)物模型。

4 體內(nèi)誘生抗原技術(shù)

由于某些病原菌缺乏適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型,Handfield M等[19]在研究口腔病原菌伴放線(xiàn)桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)時(shí)設(shè)計(jì)提出了不需要建立動(dòng)物模型的體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)。該方法通過(guò)對(duì)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選得到病原菌的體內(nèi)誘生基因。具體過(guò)程為:收集并挑選效價(jià)較高的感染過(guò)目標(biāo)病原菌的宿主血清;先后用體外培養(yǎng)的病原菌全菌體及其超聲裂解產(chǎn)物和熱處理后的超聲裂解產(chǎn)物對(duì)收集的血清進(jìn)行充分的吸附處理,以去除血清中針對(duì)病原菌體外表達(dá)的抗體亞群,血清中殘留的即為那些只在宿主體內(nèi)表達(dá)的抗體亞群;然后提取病原菌的基因組并選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體構(gòu)建病原菌的基因組表達(dá)文庫(kù),接著用吸附處理后的血清對(duì)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行檢測(cè),從而篩選得到體內(nèi)誘生基因。

Handfield M等[19]首先利用IVIAT技術(shù)發(fā)現(xiàn)了116個(gè)體內(nèi)誘生抗原,通過(guò)序列分析分為不同的功能類(lèi)群,并從中得到11個(gè)體內(nèi)誘生基因,他們還對(duì)此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)這些新的體內(nèi)誘生基因編碼的產(chǎn)物可以作為疾病的診斷標(biāo)志。Deb D K等[20]也鑒定出了6個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),并通過(guò)同源性分析推測(cè)其可用來(lái)開(kāi)發(fā)為診斷工具或作為藥物的潛在靶標(biāo)。宋潔等[21]用IVIAT技術(shù)成功篩選得到5個(gè)豬鏈球菌2型的陽(yáng)性克隆,該菌可能較以往的毒株有重要突變,具備很強(qiáng)的致病能力及體內(nèi)生存能力[22-23]。目前此法已被用于肺炎鏈球菌、白假絲酵母、O 157∶H 7型大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、霍亂弧菌[24]、流產(chǎn)布魯菌[25]、鏈球菌[26]、炭疽桿菌[27]等病原菌體內(nèi)誘生抗原的篩選。此法的優(yōu)點(diǎn)在于可用于研究不同感染階段病原菌可能產(chǎn)生的不同抗原,不需要使用動(dòng)物模型,簡(jiǎn)單快捷,可檢測(cè)瞬時(shí)基因表達(dá)和病原菌感染的不同階段。缺點(diǎn)在于只能鑒定那些可培養(yǎng)的病原;而且有些病原在宿主體內(nèi)沒(méi)有免疫原性,這樣的抗原就無(wú)法用IVIAT進(jìn)行鑒定;此法也會(huì)受到免疫交叉反應(yīng)的影響而造成假陽(yáng)性;并且IVIAT技術(shù)無(wú)法分辨出那些在體外和體內(nèi)都表達(dá)的病原基因。

5 展望

IVET、STM、GAM-BIT和IVIAT四種方法都是研究體內(nèi)誘導(dǎo)基因非常有價(jià)值的工具,針對(duì)性不同而各有差異及優(yōu)缺點(diǎn),但這些方法都有利于體內(nèi)誘生基因的研究,對(duì)闡明病原菌的致病機(jī)理有很大幫助,彼此存在互補(bǔ)。IVET是一種啟動(dòng)子捕獲策略,基于IVET法的DFI可以通過(guò)觀察綠色熒光而觀察基因表達(dá)的過(guò)程。STM是一種基于轉(zhuǎn)座子的突變技術(shù),利用這些轉(zhuǎn)座子對(duì)細(xì)菌進(jìn)行隨機(jī)突變以及動(dòng)物模型的體內(nèi)篩選,但與IVET不同,STM不需考慮基因的表達(dá)問(wèn)題。使用GAM-BIT的研究者可以對(duì)其感興趣的某段染色體區(qū)域或特定的DNA元件進(jìn)行操作(如毒力島、噬菌體等),而其他方法則不能。前三種方法可分辨出體內(nèi)誘生抗原和那些在體內(nèi)和體外都表達(dá)的病原基因,并且只適用于有合適的動(dòng)物模型的病原菌如傷寒沙門(mén)菌等。

而IVIAT適用于沒(méi)有適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型的病原菌如肺炎鏈球菌、結(jié)核分支桿菌、霍亂弧菌等,具有簡(jiǎn)單、快捷、高通量,可檢測(cè)感染不同時(shí)期的差異基因,發(fā)現(xiàn)很多以前未曾發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)誘生基因等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)作為一項(xiàng)新型的病原菌體內(nèi)表達(dá)基因檢測(cè)技術(shù),廣泛運(yùn)用于多種病原菌的研究。IVIAT的應(yīng)用可以幫助我們更準(zhǔn)確地闡明病原菌的毒力因子和致病機(jī)制,為抗菌藥物的開(kāi)發(fā)、臨床診斷試劑的研究、疫苗的設(shè)計(jì)提供新的準(zhǔn)確靶標(biāo),從而為預(yù)防和治療工作奠定基礎(chǔ)。

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