史海霞，劉 俊，薛永亮，俞林花，聶緒強(qiáng)，卞 卡，2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203;2.美國德克薩斯大學(xué)休斯敦醫(yī)學(xué)院綜合生物及藥理學(xué)系，德克薩斯大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所，休斯敦 TX77030)

血管內(nèi)皮細(xì)胞位于循環(huán)血液和血管平滑肌之間，在調(diào)節(jié)血管功能、維持血管穩(wěn)態(tài)和防止心腦血管疾病中起著至關(guān)重要的作用。在病理狀態(tài)下，以內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降、血管通透性增加、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞脫落等為主要表現(xiàn)的血管內(nèi)皮功能紊亂是諸多循環(huán)系統(tǒng)疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病等共同的始動因素及病理基礎(chǔ)。內(nèi)皮源性一氧化氮(NO)作為重要的內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)因子，其保護(hù)效應(yīng)主要是通過調(diào)節(jié)血管張力和血壓，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，抑制血小板聚集，抑制單核細(xì)胞和血小板的黏附等作用來實現(xiàn)的［1］。NO合成是內(nèi)皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)以L-精氨酸(L-Arginine)和分子氧(O－)為底物，還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)提供電子，經(jīng)由黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和四氫生物蝶呤(BH4)傳遞電子，生成中間體對羥基-L-精氨酸，經(jīng)進(jìn)一步氧化最終形成NO和L-胍氨酸。

eNOS存在于內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血小板以及肥大細(xì)胞、腎上皮組織等實質(zhì)細(xì)胞中。由于eNOS在細(xì)胞內(nèi)呈構(gòu)成型表達(dá)，對eNOS的調(diào)控研究多集中于翻譯后的蛋白水平的調(diào)控［2］。本文就近年來對eNOS的翻譯后修飾及其活性調(diào)控做一綜述。

1 eNOS

在哺乳動物，NOS有3種亞型:nNOS、iNOS和eNOS。他們分別是不同基因的產(chǎn)物，且有50% ～60%的序列同源性。eNOS作為同源二聚體，每個亞基由N端的氧化酶區(qū)和C端的還原酶區(qū)組成;在eNOS的催化反應(yīng)中，電子在還原酶區(qū)穿梭移動，連續(xù)不斷地從NADPH到FAD，最后到FMN。因為電子的轉(zhuǎn)移從eNOS一個單聚體的還原酶區(qū)到另一個單聚體的氧化酶區(qū)，因此，酶的二聚體化是酶完全活化的前提［3－4］。

2 eNOS蛋白的翻譯后修飾

eNOS的翻譯后修飾有著復(fù)雜的模式。在生理刺激和病理狀態(tài)下，翻譯后修飾動態(tài)調(diào)控酶的活性［5－7］。這些修飾包括:?；饔茫?］;鈣/鈣調(diào)素的結(jié)合［9－10］;磷酸化;S-亞硝基化［11－12］。鑒于蛋白激酶和磷蛋白磷酸酶介導(dǎo)的磷酸化和去磷酸化網(wǎng)絡(luò)是調(diào)節(jié)eNOS活性的主要的翻譯后修飾［2，13］，因此，本文主要闡述eNOS不同氨基酸殘基的磷酸化和去磷酸化對其活性的調(diào)控及其分子機(jī)制。

2.1 eNOS的磷酸化調(diào)控目前研究表明，eNOS的磷酸化可以發(fā)生于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點，拓寬了eNOS活性調(diào)節(jié)中磷酸化的潛在作用。雖然據(jù)推測存在眾多的磷酸化位點，但是最經(jīng)典的功能性的磷酸化序列是位于還原酶區(qū)的絲氨酸位點(人的eNOS Ser1177、牛的eNOS Ser1179)和位于鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)的蘇氨酸位點(人的eNOS Thr495、牛的eNOS Thr497)［2］。此外還包括:Ser635，Ser617和 Tyr83的磷酸化上調(diào)eNOS的酶活性，eNOS Ser116、Thr495和 Tyr653磷酸化則下調(diào)eNOS 的活性［14］(Fig 1)。

2.1.1 上調(diào)eNOS活性的磷酸化位點及相關(guān)信號通路Ser1177:在未經(jīng)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞，Ser1177位點并非磷酸化狀態(tài)，但是在刺激因素如流體切應(yīng)力［15－16］、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)［17－18］和緩激肽［19］作用下則發(fā)生迅速的磷酸化。eNOS Ser1177位點磷酸化激活eNOS的催化功能的機(jī)制是由于抑制了CaM從eNOS的解離和上調(diào)了eNOS酶內(nèi)部的電子轉(zhuǎn)移率［20］。在此過程中，因刺激因素不同對eNOS激活所涉及信號通路各不相同，如流體切應(yīng)力刺激eNOS Ser1177磷酸化是通過蛋白激酶A(PKA)信號通路;而胰島素、雌激素和VEGF則主要通過Akt信號通路使eNOS發(fā)生該位點的磷酸化;心肌缺血通過AMPK信號通路使eNOS Ser1177磷酸化［21］;另一方面，緩激肽、鈣離子載體以及毒胡蘿卜素所介導(dǎo)的eNOS Ser1177的磷酸化，則是由鈣調(diào)素激酶Ⅱ(CaMKⅡ)介導(dǎo)的［19，22］。

Fig 1 Overview of principal eNOS post-translational modifications

有研究表明，在體外，高血糖［23］和葡萄糖造成的白蛋白終末期糖基化終產(chǎn)物［24］，類似于人的 2型糖尿病［25］，可以通過氧結(jié)合的N-乙?；腔揎梕NOS Ser1177。相對于未經(jīng)過糖基化修飾的蛋白，以這種方式修飾的蛋白易于磷酸化不足，并且可能通過掩蓋磷酸化位點而引起eNOS的活性下降，使得NO的生成減少。

Ser635:Ser635定位于自抑制環(huán)內(nèi)，被認(rèn)為呈折疊狀態(tài)以阻礙鈣調(diào)素的結(jié)合，從而抑制酶的活性。有體外研究提示Ser635可以通過PKA和PKG通路被磷酸化［26］，但在NO的生成過程中，Ser1177的磷酸化起關(guān)鍵作用而Ser635的磷酸化未檢測到或結(jié)果不明顯［15－16］。最近，有研究表明［27－28］在流體切應(yīng)力、VEGF、緩激肽和8-bromocAMP刺激下，Ser635通過PKA信號通路發(fā)生緩慢的磷酸化，磷酸化速率要慢于Ser1177和Thr495。

Ser617:此位點的磷酸化是通過磷光肽鏈圖譜法識別的，機(jī)制涉及PKA和Akt信號通路。模擬Ser617位點的磷酸化可以明顯增加eNOS對Ca2+/CaM的敏感性，但未報道能改變酶的最大活性［28］。但是，Ser617也許在調(diào)節(jié)其他位點的磷酸化中起重要作用，如蛋白－蛋白間的相互作用［29］。

Tyr83:氧化應(yīng)激和v-Src過表達(dá)可以介導(dǎo)eNOS氧化酶區(qū)的Tyr83發(fā)生磷酸化［30］。這種修飾可以上調(diào)原位的NO輸出，但是在體外實驗中，野生型和此位點苯丙氨酸突變的eNOS酶活性并無差別，因此，似乎Tyr83位點的磷酸化并非直接調(diào)控eNOS的活性，也許是通過調(diào)節(jié)酶對鈣離子的敏感性、蛋白－蛋白之間的相互作用或改變eNOS的亞細(xì)胞定位而實現(xiàn)的。新近實驗證實，在原代和培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，Src依賴的eNOS Tyr83磷酸化可以由激動劑毒胡蘿卜素、VEGF、緩激肽、ATP、磷酸神經(jīng)鞘脂、雌激素、血管形成素和乙酰膽堿所誘導(dǎo)［31］。至此，盡管不同的 eNOS激動劑均可以介導(dǎo)Tyr83位點的磷酸化，但此磷酸化位點的具體改變及相關(guān)的分子機(jī)制，尚有待探索。

2.1.2 下調(diào)eNOS活性的磷酸化位點及相關(guān)信號通路Ser116:此位點呈結(jié)構(gòu)性磷酸化。有研究表明，一條涉及磷酸酶神經(jīng)鈣蛋白的信號通路使Ser116位點的去磷酸化而激活eNOS。免疫抑制劑環(huán)孢素A抑制神經(jīng)鈣蛋白(Calcineurin)，阻斷VEGF介導(dǎo)的Ser116位點的去磷酸化，這一潛在的機(jī)制也許可以為其引起高血壓的機(jī)制提供一個解釋［5，32－33］。

Thr495:該調(diào)節(jié)位點呈結(jié)構(gòu)性磷酸化表達(dá)于所有內(nèi)皮細(xì)胞并下調(diào)酶的活性［19，32，34］，其機(jī)制是由于該位點的磷酸化阻礙了鈣調(diào)素與其結(jié)合位點的結(jié)合。促使Thr495磷酸化的激酶很可能是 PKC［18－19，35］，因為 PKC 抑制劑和下調(diào) PKC 可以明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞生成NO的量［36］。有報道稱在體外實驗，Thr495位點的磷酸化可以通過血管形成素-1(angiopoietin-1)依賴的方式抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加［37］;糖尿病和吸煙也以此機(jī)制介導(dǎo)eNOS活性的下調(diào)［38］。與此相反，刺激因素(如緩激肽、組胺和鈣離子載體)介導(dǎo)的Thr495位點的去磷酸化可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣水平，使eNOS活性上調(diào)。

Tyr657:應(yīng)用質(zhì)譜分析法明確了Tyr657定位于eNOS酶的FMN結(jié)合域，在細(xì)胞內(nèi)磷酸化的同時c-Src或富含脯氨酸的酪氨酸激酶(PYK2)的表達(dá)上調(diào)［39］。PYK2被認(rèn)為是誘導(dǎo)eNOS磷酸化的負(fù)性調(diào)控激酶，可以阻斷血流介導(dǎo)的NO依賴的頸動脈舒張［39］。最近研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓模型，AT1受體和NOX-2依賴的PYK2活化抑制eNOS，再次證實了 eNOS Tyr657位點的磷酸化和 PYK2的激活有關(guān)［40］。有研究表明，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，通過和eNOS免疫共沉淀檢測［41］的方法證實H2O2除了激活PYK2，還使蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2失活——一個失活PYK2從而可以潛在調(diào)控eNOS活性的蛋白［42－43］。人們推測作為PYK2介導(dǎo)的eNOS磷酸化的結(jié)果，eNOS的失活可能在動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，也許在此病理狀態(tài)下PYK2充分活化而下調(diào)了eNOS的活性。

2.1.3 eNOS磷酸化的綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 一個世紀(jì)以前人們還簡單地認(rèn)為eNOS的活化是緣于鈣/鈣調(diào)素的結(jié)合，此后，關(guān)于eNOS調(diào)控的其它機(jī)制與作用迅速增加，尤其是多種不同的激酶、不斷增加的相互作用蛋白以及亞細(xì)胞定位對eNOS絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的調(diào)控。日益增長的認(rèn)識逐漸向人們展示了一個復(fù)雜的eNOS活性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。緩激肽對eNOS活性的調(diào)控就是體現(xiàn)這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性的很好的例子:緩激肽與B2受體結(jié)合刺激細(xì)胞內(nèi)的鈣流，由此通過鈣調(diào)素的結(jié)合而激活eNOS，同時小窩蛋白-1(caveolin-1)從eNOS解離。此外，緩激肽還刺激eNOS和熱休克蛋白90(heat shok protein 90，hsp90)和細(xì)胞膜孔道蛋白的結(jié)合，減少eNOS與B2受體的結(jié)合。同時，緩激肽通過促進(jìn) eNOS Ser1177、Ser617、Ser635的磷酸化和 Thr495的去磷酸化而上調(diào)eNOS的活性，繼而促進(jìn)NO的合成。蛋白激酶Akt、CaMKⅡ和PKA以及PP1、PP2B均參與了此磷酸化調(diào)控過程。緩激肽還可以瞬時地改變eNOS的亞細(xì)胞分布。所有這些同時發(fā)生的分子事件共同確保在合適的細(xì)胞定位及合適的時間介導(dǎo)適量的NO釋放。但是，這些事件之間的相互作用尚未完全闡明［13］。

2.2 中藥對eNOS磷酸化的調(diào)控Kang等［44］研究表明，中藥復(fù)方清活1號及其有效成分川芎嗪在bEnd.3、HUVEC及HAEC細(xì)胞均可以逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的eNOS Ser1177位點和Akt的磷酸化水平的下降，從而發(fā)揮其在糖尿病血管病變中的保護(hù)作用;郭玉等［45］實驗證實，金粉蕨素通過上調(diào)eNOS活性和ERK1/2的磷酸化水平而發(fā)揮抗氧化損傷作用。魏晉等［46］研究表明，(R，R)ZX-5能夠通過上調(diào)eNOS的表達(dá)和活力，增加NO的釋放，進(jìn)而增加脈絡(luò)膜的血流。小檗堿(berberine)是黃連根莖中所提取出的生物堿，有研究表明［47］小檗堿可以濃度依賴性增強(qiáng)離體培養(yǎng)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS Ser1177的磷酸化，促進(jìn)eNOS與hsp90的結(jié)合而增加NO的產(chǎn)生。

3 結(jié)語

近年來，隨著研究的逐漸深入，eNOS的活性調(diào)控呈現(xiàn)出一個復(fù)雜而精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這也反映了NO系統(tǒng)的精密調(diào)控在維持循環(huán)系統(tǒng)健康中的重要性。心血管系統(tǒng)疾病如冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等均存在NO的生物利用度不足的病理狀態(tài)。eNOS不同氨基酸殘基的磷酸化對其活性調(diào)控的機(jī)制亦各異，這些機(jī)制的闡明將有助于我們理解并利用這些機(jī)制開發(fā)改善內(nèi)皮功能障礙的新藥。中藥及其有效活性成分在這些方面的深入研究尚較少，由于eNOS絲/蘇氨酸的磷酸化是一個快速反應(yīng)的過程，如果能篩選出對這一調(diào)控機(jī)制有干預(yù)作用的中藥及其有效活性成分，將有助于發(fā)揮中藥對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。

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