王聯(lián)發(fā)，顧 磊，吳振西，羅 駿，張淑華

(1.中國人民解放軍105醫(yī)院心內二科，合肥230001;2.江西省人民醫(yī)院心血管研究所，南昌330006)

心房纖顫(簡稱房顫)是臨床上最常見的持續(xù)性心律失常，可引起心力衰竭、腦卒中等嚴重的并發(fā)癥，其防治一直是臨床實踐中的難點。研究證實心房結構重構和電重構在房顫的發(fā)生和維持中起重要作用，而心房肌L型鈣離子通道在電重構中起著關鍵作用。本研究通過人工心臟起搏的方法建立急性家兔房顫模型，檢測心房肌鈣離子通道α1C亞基及β1的表達的變化，探討螺內酯對急性房顫心房L型鈣離子通道亞基表達的影響，從而為螺內酯應用于臨床防治房顫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取健康普通家兔18只，雌雄不限，由南昌大學實驗動物中心提供，體質量2.0～ 3.2 kg。隨機分為 3組，對照組、起搏組、螺內酯組，各6只。螺內酯組以螺內酯20 mg/(kg·d)灌胃給藥2周，其余兩組以等容量生理鹽水灌胃2周。

1.2 房顫模型的建立 3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg經兔耳緣靜脈注射麻醉后，靜脈推注肝素1000 U;將兔仰臥固定于兔臺，記錄體表心電圖，頸部正中切口，分離右側頸內靜脈并切開，近頭端結扎，置入1根4F四極電極導管(電極間距5 mm)至右房，插入深度約6 cm，將遠端電極對與心電圖左、右手電極相連，心電圖機調為Ⅰ導聯(lián)，記錄心內雙極導聯(lián)心電圖，示大A小V，表明電極位于右心房，固定好電極導管。經耳緣靜脈注射阿托品和美多心安以阻斷自主神經對心率的影響，阿 托 品 首 劑 0.04 mg/kg靜 脈 推 注，以 后0.007 mg/(kg·h)靜脈滴注維持，美多心安首劑0.2 mg/kg，以后 0.02 mg/(kg·h)維持。起搏組和螺內酯組采用心臟電生理刺激儀連續(xù)單刺激模式進行8 h的快速心房起搏，起搏周長 100 ms，脈寬0.5 ms，電壓4 V。對照組植入起搏電極，但不行高位快速右房起搏刺激。

1.3 L型鈣通道α1C、β1亞基mRNA表達的測定

1.3.1 引物設計 根據(jù)設計要求，應用 Primer5.0軟件進行設計，送上海博亞生物技術有限公司合成，引物長度和反應條件見表1。

表1 引物序列及聚合酶鏈反應條件

1.3.2 RNA的提取 根據(jù)實驗分組，起搏結束后，在家兔麻醉的狀態(tài)下，無菌技術開胸，迅速取出心臟，在無鈣臺氏液中漂洗心臟，剪下右心房組織，放入液氮中冷凍保存。將心房組織充分研磨、勻漿，在RNA提取試劑Trizol中充分勻漿，按照Trizol試劑盒操作說明提取總RNA，所提RNA溶于30 μL無酶水中，核酸定量測定儀測定RNA濃度和純度，并行質量分數(shù)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA的完整性。

1.3.3 心房肌α1C及β1mRNA的檢測 反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組心房肌α1C和β1mRNA的變化。將1 μg總RNA按照Promage試劑盒操作步驟行20 μL體系反轉錄反應，所得cDNA作為模板，后續(xù)25 μL體系PCR試驗。PCR體系:5 μL cDNA，12.5 μL PCR Master Mix，5.5 μL 無核酶水，上游及下游引物(10 μmol/L)各1 μL。PCR產物在質量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像并測定吸光度值(A值)，以GAPDH為內參照，將Aα1C/AGAPDH以及Aβ1/A GAPDH比值進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 L鈣通道各亞基mRNA產物的電泳結果 L鈣通道各亞基mRNA經半定量RT-PCR電泳結果見圖1，各目的基因和內參GAPDH擴增條帶位置和理論值相符。

圖1 L型鈣離子通道α1C和β1的mRNA產物的瓊脂糖電泳結果

2.2 L型鈣通道各亞基mRNA的表達結果 快速心房起搏8 h后，心房肌L型鈣通道α1C和β1亞基mRNA表達與對照組相比分別下降22%和26%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而螺內酯組下降幅度明顯減少，分別為13%和17%，與起搏組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明螺內酯對快速心房起搏導致的L型鈣離子通道表達有一定的保護作用(表2)。

表2 L型鈣通道各亞基mRNA的表達結果

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，心房電重構在房顫的發(fā)生和維持中起著關鍵的作用，而L型鈣通道可能是快速心房肌電生理重構的始動因素。鈣通道離子流是心肌細胞動作電位及其興奮功能的主要組成部分，心肌細胞有多種Ca2+通道蛋白，其中L型鈣離子通道在心臟復極中起重要作用，L型鈣通道在動作電位初始時即被激活產生內向電流，并延續(xù)整個平臺期，所以L型鈣通道功能的變化，都可導致心律失常。Ica-L通道在心房重構中起著重要的作用，已經在許多動物試驗及臨床試驗中得到證實［1，2］。van der Velden等［3］在山羊模型上同樣觀察到與竇性心律相比，持續(xù)性房顫心房肌的α1C的mRNA表達顯著降低。國內馬瑞彥等［4］通過心房快速起搏家兔模型發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道亞單位α1C的表達在快速起搏3 h后無變化，起搏6 h后表達明顯下調17.35%，起搏12 h時進一步下調。1995年Wijffels等［5］利用快速心房起搏建立房顫的山羊動物模型，并發(fā)現(xiàn)心房快速起搏引起的電生理改變與房顫患者相同，奠定了快速心房起搏模型用于房顫發(fā)生機制研究的基礎。本實驗利用家兔快速心房起搏8 h模擬建立心房纖顫的模型來觀察L型鈣離子通道的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，快速起搏組心房肌L型鈣離子亞基mRNA表達下降，可引起心房肌細胞動作電位2相時程相對縮短，使該部位心肌復極相對加速，從而導致各部位心房肌復極不一致，容易形成房內折返，發(fā)生房性心律失常。螺內酯組心房肌細胞L型亞基mRNA表達下降幅度減小，提示螺內酯可通過抑制L型鈣通道下降，使動作電位時程延長，使心房肌細胞電生理活動變化減小，減少心律失常發(fā)生，產生心肌保護作用。

大量的研究證實醛固酮在心房重構中起著重要的作用。早在20世紀90年代，Berglund等［6］研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者的血清醛固酮水平明顯高于竇性心律者。Goette等［7］發(fā)現(xiàn)，房顫發(fā)作時血清醛固酮水平明顯升高，在電復律48 h后血清醛固酮水平較復律前顯著下降，而房顫復發(fā)后血清醛固酮水平又再次升高。Dixen等［8］研究發(fā)現(xiàn)，與竇性心律者相比，房顫患者血漿醛固酮水平明顯升高。醛固酮在房顫中的作用日益引起人們的關注，以往認為使用血管緊張素轉化酶抑制劑或血管及張素受體拮抗劑類藥物就能有效抑制醛固酮的作用，然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于“醛固酮逃逸”現(xiàn)象的存在，血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑類藥物并不能完全長期抑制醛固酮的產生。醛固酮受體拮抗劑螺內酯作為利尿劑在臨床上廣泛應用于心力衰竭、高血壓等疾病的治療，在實驗中觀察到螺內酯雖然能夠在一定程度上降低快速心房起搏家兔心房肌細胞的L型鈣通道亞基mRNA下降的趨勢，但是僅僅研究了螺內酯對急性房顫L型鈣通道亞基具有一定的保護作用，是否對慢性房顫也具有類似效果，還需要進一步探討。相信，隨著對醛固酮受體拮抗劑在房顫中作用研究的深入，醛固酮受體拮抗劑螺內酯有可能成為未來逆轉心房重構，降低心房纖顫的發(fā)生率，防止心房纖顫復發(fā)的重要措施之一。

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［4］馬瑞彥，肖穎彬，陳勁進.快速心房起搏對家兔心房肌細胞內鈣離子濃度及L-型鈣通道表達的影響［J］.中華醫(yī)學雜志，2006，86(27):1926-1928.

［5］Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats［J］.Circulation，1995，92(7):1954-1968.

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［8］Dixen U，Ravn L，Soeby-Rasmussen C，et al.Raised plasma aldosterone and natriuretic peptides in atrial fibrillation［J］.Cardiology，2007，108(1):35-39.