周傳友，朱亞林，賀 瑞，胡 飛，吳 旅，尚希福

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨二科，合肥230001)

激素性股骨頭壞死的發(fā)病率逐年增高，占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首位［1］。激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機(jī)制并不完全明確，它可能有多種發(fā)病機(jī)制。如血管的機(jī)械損傷、動脈的血栓和栓塞、靜脈回流受阻、持續(xù)增高的骨內(nèi)壓等。但不論何種病因，其共同特點是均損害了股骨頭的血運，引發(fā)股骨頭壞死。治療關(guān)鍵是盡早發(fā)現(xiàn)，干預(yù)性治療，重建血供，防治股骨頭塌陷、變形。髓芯壓是最常用的方法，已經(jīng)應(yīng)用30多年，但其療效仍然有很多爭議。隨著生物技術(shù)、組織工程技術(shù)與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，對早期激素性股骨頭缺血性壞死的治療帶來新希望。本實驗通過建立兔早期激素性股骨頭壞死模型，采用髓芯減壓，將體外增殖的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)聯(lián)合重組人骨發(fā)生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)/重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(recombinant human vascular endothelial growth factor，rhVEGF)治療壞死的股骨頭，為臨床治療早期激素性股骨頭壞死提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年新西蘭白兔35只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg(由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供);rhBMP-2、rhVEGF分別與卵磷脂混合制成三種片狀混合物:rhBMP-2 0.5 mg+卵磷脂40 mg/片;rhBMP-2 0.5 mg+rhVEGF 0.5 mg+卵磷脂40 mg/片，單純卵磷脂40 mg/片(廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司);光學(xué)顯微鏡由安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立、分組及處理 所選動物均采用Qin等［2］使用的實驗方法建立激素性股骨頭壞死動物模型。30只兔激素性股骨頭壞死動物模型，隨機(jī)分為5組，每組6只，A組:模型對照組;B組:單純減壓;C組:減壓同時植入BMSCs;D組:減壓同時植入BMSCs及rhBMP-2卵磷脂。E組:減壓同時植入BMSCs及rhBMP-2/rhVEGF卵磷脂。所有動物雙側(cè)股骨頭均參加實驗，術(shù)后4、8周各組處死3只動物，作X線檢查、組織學(xué)觀察。

1.2.2 BMSCs的獲取和培養(yǎng) 用硬膜外穿刺針刺入兔髂骨1～1.5 mm，以含有100/mL 肝素0.2 mL 的5 mL注射器迅速抽取骨髓2 mL，所獲骨髓種植于6孔胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔種植1 mL，每只實驗動物種植2個孔。入含20%胎牛血清DMEM液5 mL，反復(fù)吹打，再加入地塞米松10-8mmol/L，微型震蕩器上震蕩2 min，然后放入細(xì)胞養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度37℃，含5%CO2，100%飽和濕度。5 d后換液，沖去紅細(xì)胞，可見多個成纖維細(xì)胞克隆貼壁長。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔面積一半時，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔傳代，2～3 d可見細(xì)胞長滿培養(yǎng)孔，將其按1×106/cm2密度傳入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。待第三代細(xì)胞長滿后，消化細(xì)胞將細(xì)胞配成2×106/cm2細(xì)胞懸液，復(fù)合于3 cm×4 cm的明海綿上。每塊明膠海綿含細(xì)胞懸液50 μL，共10萬個細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h備用。

1.2.3 X線檢查 攝髖正位及蛙式位X線片，觀察股骨頭結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 組織學(xué)觀察 剖取雙側(cè)股骨頭連同干骺端，肉眼觀察后，置于 10%中性甲醛液 0.1 mol/L，pH 7.4固定3 d。然后置于10%EDTA-Tris緩沖液中脫鈣(將 EDTA 溶于 0.1 mol/L，pH 7.4的 Tris-HCL緩存液中制成)，每周更換脫鈣液1次，觀察骨標(biāo)本表面顏色并用物理法測定其脫鈣程度。脫鈣完全后取材，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片然后行HE染色。光鏡觀察股骨頭骨質(zhì)、骨髓的組織結(jié)構(gòu)變化及骨組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化等。在切片中觀察骨陷窩時，高倍鏡下10×40任選5個高倍視野，計數(shù)50個骨細(xì)胞空骨陷窩陽性數(shù)，取其均數(shù)。當(dāng)觀察血管數(shù)目時，在軟骨下區(qū)依次任選5個高倍視野，計血管數(shù)目，求出平均值。取置于3%戊二醛液中固定的標(biāo)本，經(jīng)緩沖液沖洗后乙醇逐級脫水，醋酸異戊酯保存12 h，CO2臨界點干燥并真空噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析F檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的生長觀察及鑒定 骨髓培養(yǎng)到第5天，沖去表面紅細(xì)胞，可見每個孔內(nèi)有3～7個成纖維細(xì)胞樣克隆集落貼壁生長，呈放射狀，直徑大小不等。單個細(xì)胞呈長梭形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核居中，換液2～3 d后細(xì)胞克隆增大，待細(xì)胞生長占滿培養(yǎng)孔一半時消化傳代。消化傳代后細(xì)胞首先呈圓形透亮，2～4 h后貼壁生長變成短梭形，2～3 d后細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底，呈長梭形緊密排列。3代細(xì)胞接種后2～7 d呈指數(shù)生長，倍增時間為48 h。

2.2 X線檢查 4周時A組密度有所增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，密度增高，B組缺損清晰可見，缺損區(qū)未見骨質(zhì)形成，其余各組減壓區(qū)密度低于周圍骨組織。8周時A組骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨下囊性變，B組缺損仍清晰可見，C組減壓區(qū)骨密度低于周圍骨組織，D、E組骨減壓區(qū)密度不均與宿主骨密度相當(dāng)，分界不清。

2.3 組織學(xué)檢查 A組呈典型骨壞死，骨小梁變細(xì)、斷裂，可見血管栓塞、空骨陷窩及以纖維結(jié)締組織為主的修復(fù)反應(yīng);B組4周時開始有新骨形成，但8周時骨組織的成熟度仍不均一;C組4周時可見成骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞，但8周時骨改建仍未完成，新生血管少，見少量空骨陷窩;D組4周空骨陷窩減少，可見增生活躍的成骨細(xì)胞，并見少量增生血管，新生血管生長不及E組活躍，8周時可見新生骨小梁，新骨改建接近正常松質(zhì)骨;E組4周時新骨開始形成，新生血管生長活躍，出現(xiàn)大量的新生骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞，8周時新骨改建接近正常松質(zhì)骨。各組術(shù)后4、8周后空骨陷窩計數(shù)及血管數(shù)目計數(shù)見表1，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，E組骨陷窩陽性數(shù)及與血管數(shù)目與各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組術(shù)后4、8周后空骨陷窩及血管數(shù)目計數(shù)(±s，個)

表1 各組術(shù)后4、8周后空骨陷窩及血管數(shù)目計數(shù)(±s，個)

A組24.50 ±1.38 24.33 ±1.37 3.83 ±1.47 3.17 ±1.17 B 組 22.17 ±1.33 20.17 ±1.17 4.50 ±1.38 5.00 ±1.41 C 組 19.67 ±1.37 16.33 ±0.82 5.33 ±1.03 5.17 ±0.98 D 組 17.33 ±1.03 11.33 ±0.82 5.00 ±1.41 5.50 ±1.05 E 組 14.33 ±1.21 8.17 ±0.41 7.17 ±1.17 8.50 ±1.38 F 53.694 275.126 5.539 15.136 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

激素性股骨頭壞死的發(fā)病率逐年增高，但其病因、發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前尚無定論，但其最后均出現(xiàn)一個共同特征——骨內(nèi)微循環(huán)受阻，血流淤滯，從而使骨髓組織壓力增高，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致股骨頭缺血壞死以及隨之出現(xiàn)的修復(fù)反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生股骨頭壞死、塌陷及髖骨關(guān)節(jié)炎，是一個惡性循環(huán)的發(fā)病過程。早期治療的關(guān)鍵是恢復(fù)股骨頭的血液供應(yīng)、促進(jìn)壞死骨組織的修復(fù)、防治股骨頭塌陷及骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。股骨頭壞死臨床上治療方法很多，但目前尚無一種療效確實可靠、得到公認(rèn)的方法可治愈股骨頭壞死。髓芯減壓術(shù)因其創(chuàng)傷小，易操作，是治療早期股骨頭缺血性壞死最常用的方法，并已經(jīng)應(yīng)用30多年，但其臨床療效一直存在爭議。部分學(xué)者認(rèn)為髓芯減壓術(shù)治療效果與疾病分期有關(guān)。Mont等［3］研究發(fā)現(xiàn)，該術(shù)式對早期病例療效良好，臨床有效率分別為:Ⅰ期84%，Ⅱ期65%，Ⅲ期47%。

Hernigou等［4］研究激素性股骨頭壞死患者壞死區(qū)BMSCs數(shù)目和活性的變化，認(rèn)為激素可以降低前體細(xì)胞的數(shù)量和活性。陳炳鵬等［5］也認(rèn)為，雖然髓芯減壓術(shù)可以降低骨內(nèi)壓并刺激減壓針道周圍的血管形成，增強(qiáng)壞死骨的爬行替代，但是并沒有徹底解決股骨頭的修復(fù)問題，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量的減少可能是股骨頭修復(fù)不完全的主要原因。因此，股骨頭缺血性壞死可以認(rèn)為是一種骨髓基質(zhì)干細(xì)胞減少病。嚴(yán)軍等［6］通過自體骨髓移植治療兔實驗研究發(fā)現(xiàn)，治療組骨修復(fù)較空白對照組活躍，骺板損傷處可見少量軟骨細(xì)胞，單純鉆孔組以纖維修復(fù)為主，認(rèn)為由于BMSC數(shù)目較少，自體骨髓移植治療兔Perthes病模型能力有限，體外培養(yǎng)增殖BMSC，增加植入細(xì)胞數(shù)目，有利于股骨頭壞死的修復(fù)。

BMSCs是一種多能干細(xì)胞，能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞，并且在成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化之間呈反向變化［7］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞不但具有體外成骨能力，同樣也具有體內(nèi)成骨能力。體外實驗證實激素能促使BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，而抑制其向成骨細(xì)胞分化［8］。Kon等［9］將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞接種于羥基磷灰石載體上，修復(fù)綿羊骨缺損，2個月后發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石孔內(nèi)及周圍均有骨形成。

牛東生等［10］發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死骨髓基質(zhì)中成骨蛋白2及VEGF表達(dá)減少，并認(rèn)為其與股骨頭內(nèi)的成骨活動、基質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及血管生成密切相關(guān)。胡志明等［11］將血管內(nèi)皮生長因子脂質(zhì)體治療壞死的兔股骨頭，5周發(fā)現(xiàn)股骨頭結(jié)構(gòu)變清晰，骨質(zhì)破壞明顯修復(fù)，軟骨細(xì)胞修復(fù)性增生，骨髓腔造血組織出現(xiàn)增生，栓塞的血管旁邊出現(xiàn)新生的血管。孫明林等［12］通過髓芯減壓聯(lián)合rhBMP-2治療兔激素性股骨頭缺血性壞死，術(shù)后8周發(fā)現(xiàn)原骨缺損區(qū)基本消失，大量相對較成熟的骨小梁及板狀骨并存。Yeh等［13］發(fā)現(xiàn)，VEGF通過促進(jìn)局部血管增生和成骨細(xì)胞分化而參與了成骨活動，而成骨蛋白等則通過提高成骨細(xì)胞VEGF的表達(dá)而在骨的形成和修復(fù)中發(fā)揮作用，這些骨生長因子可刺激VEGF在體內(nèi)表達(dá)，VEGF不足可導(dǎo)致血管腔閉合，血管退化。所以，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞若能結(jié)合其他促進(jìn)股骨頭隧道內(nèi)血管再生及骨形成的細(xì)胞因子治療股骨頭壞死，將加快股骨頭的修復(fù)，提高臨床療效。

本實驗正是通過將體外培養(yǎng)的 BMSCs聯(lián)合rhBMP-2/rhVEGF治療兔激素性股骨頭壞死，結(jié)果顯示股骨頭結(jié)構(gòu)清晰，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，骨質(zhì)破壞明顯修復(fù)，股骨頭的空缺骨陷窩數(shù)明顯減少，出現(xiàn)大量新生骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞及生長活躍的新生血管，骨陷窩陽性數(shù)及血管數(shù)目各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。BMSCs聯(lián)合rhBMP-2/rhVEGF治療兔激素性股骨頭壞死具有較好的療效。但rhBMP-2及rhVEGF外源性細(xì)胞因子用于股骨頭缺血性壞死的治療是一個極其復(fù)雜的過程，其在人體內(nèi)發(fā)揮作用的確切機(jī)制及代謝途徑，以及體內(nèi)微環(huán)境對它們作用的影響等均不十分明確，因此對于外源性細(xì)胞因子治療股骨頭缺血性壞死的研究期待進(jìn)一步深入，從而為最終將其過渡至臨床治療提供理論依據(jù)。

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