師長(zhǎng)宏 ,毛峰峰,趙 勇,張 海,張彩琴,白 冰,趙善民

自噬在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis,MTB)的固有免疫應(yīng)答中起重要作用,通過(guò)自噬,入侵的 MTB可被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞,在自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes,Atg)的調(diào)控下,來(lái)源于高爾基復(fù)合體、線粒體等細(xì)胞器蛋白成分組成新的膜性結(jié)構(gòu)將MTB包裹,形成自噬體結(jié)構(gòu)[1]。自噬體形成后可與溶酶體融合,并借助于溶酶體酸性環(huán)境降解入侵的MTB,從而達(dá)到免疫防御的目的[2]。但部分MTB毒株可以在巨噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活,從而逃避巨噬細(xì)胞的免疫殺傷作用,提示可能存在某些免疫逃逸機(jī)制。ESA T6和CFP10是結(jié)核分枝桿菌重要的毒力因子,參與MTB的致病過(guò)程[3]。本研究通過(guò)雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬模型,觀察 ESAT6和CFP10融合蛋白對(duì)MTB感染的小鼠巨噬細(xì)胞中自噬體形成的影響,探討該融合蛋白抑制自噬體清除MTB的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自于 Gibco公司。RNA提取、RT-PCR試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)自于杭州天根生物科技公司。β-actin抗體和Syber Green實(shí)時(shí)定量試劑盒由西安舟鼎國(guó)公司提供。7H10培養(yǎng)基購(gòu)自于Becton Dicksion公司。MTB H37Rv菌株由本室保存。純化的 ESAT6-CFP10融合蛋白、抗atg5多克隆抗體及抗atg8單克隆抗體均由本室制備并保存[4-5]。自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin)和自噬抑制劑3-MA由Sigma公司提供。小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7、MTB毒株 H37Rv均由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保存。

1.2 自噬體檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分4組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)樣,分別為自噬誘導(dǎo)組、融合蛋白作用組、自噬抑制組和雷帕霉素組。自噬誘導(dǎo)組:1×105小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,加入50nmol/L的雷帕霉素作用3h,然后按MOI=1∶10比例加入1×108CFU的 H37Rv菌株作用4h,PBS(PH7.4)緩沖液洗脫3次以洗脫未結(jié)合的 H37Rv菌株。融和蛋白作用組:25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用小鼠巨噬細(xì)胞3h后,加入50nmol/L的雷帕霉素作用3h后,按 MOI=1∶10比例加入1×108CFU的H37Rv菌株作用4h。自噬抑制組:小鼠巨噬細(xì)胞加入自噬抑制劑3-MA(600 mg/L)作用12 h,然后按MOI=1∶10比例加入1×108CFU的 H37Rv菌株作用3 h。雷帕霉素組:小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,加入50nmol/L的雷帕霉素作用3h。上述細(xì)胞以0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞,20%鋨酸固定過(guò)夜,透射電鏡觀察自噬體的形成。

1.3 菌落形成單位(CFU)檢測(cè) ESAT6-CFP10融合蛋白作用組、自噬誘導(dǎo)組和自噬抑制組小鼠巨噬細(xì)胞用0.05%Triton X-100處理后收集,7 000r/min離心,收集沉淀,重懸后1∶107稀釋,取 100μL懸液接種于 7H10瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)21d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),所有實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)重樣。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)atg mRNA表達(dá)水平 根據(jù) Gen-Bank報(bào)道的 atg基因序列 ,分別設(shè)計(jì) atg5、atg7、atg8、atg12特異性引物用于實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)。atg5上游引物為5’atgacagatgacaaagatg 3’,下游引物為 5’ctcataaccttctgaaagtg 3’;atg7上游引物為 5’atgggggaccctggactgg 3’,下游引物為5’gcagagtcaccattgtag 3’;atg8 上游引物為 5’tcggagaagaccttcaag 3’,下游引物為 5’catgttgacatggtcagg 3’;atg12 上游引物為 5’atgtcggaagattcagagg 3’,下游引物為 5’tttcttggtgtctccgggag 3’。上述各組細(xì)胞收集后加入1 mL TRIzol提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行cDNA第一鏈合成。以cDNA為模板,加入25μL Syber Green進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 2 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。atg mRNA相對(duì)定量通過(guò)下列公式計(jì)算[5]:atg mRNA=2-△ct×100。

1.5 免疫印跡檢測(cè)atg5、atg8蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞以RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行 SDSPAGE電泳,將預(yù)先處理的 PVDF膜與 PAGE膠相貼,在恒壓100V條件下轉(zhuǎn)移電泳1h,50g/L脫脂奶封閉后,分別加入1∶50稀釋的鼠抗atg5多克隆抗體及atg8單克隆抗體,同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,4℃過(guò)夜,1g/L Tween-20 PBS洗滌后,加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體,37℃放置1h。PBS洗滌后,加入底物液顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性采用LSD-t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 自噬體檢測(cè) 雷帕霉素作用小鼠巨噬細(xì)胞3h后感染H37Rv毒株,透射電鏡下可發(fā)現(xiàn)由單層膜組成的自噬囊泡出現(xiàn),見(jiàn)圖1A;同樣,雷帕霉素也可直接誘導(dǎo)自噬體形成,見(jiàn)圖 1B;當(dāng)加入 ESAT6-CFP10融合蛋白后,結(jié)果見(jiàn)圖1C,小鼠巨噬細(xì)胞中自噬體形成數(shù)目明顯減少(P<0.05,與自噬誘導(dǎo)組和雷帕霉素組相比較),達(dá)到自噬抑制組相同的水平,見(jiàn)圖1D;而相同條件下,未加融和蛋白的對(duì)照組小鼠巨噬細(xì)胞中自噬體數(shù)目無(wú)明顯變化,見(jiàn)圖1A,表明ESAT6-CFP10融合蛋白抑制了小鼠巨噬細(xì)胞自噬體的形成。

圖1 ESAT6-CFP10融合蛋白對(duì)MTB感染的小鼠巨噬細(xì)胞自噬體形成的影響A:雷帕霉素誘導(dǎo)感染MTB后巨噬細(xì)胞形成的自噬體(自噬誘導(dǎo)組);B:雷帕霉素誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞形成的自噬體(雷帕霉素組);C:ESAT6-CFP10融合蛋白作用后巨噬細(xì)胞形成的自噬體(融合蛋白作用組);D:3-MA抑制巨噬細(xì)胞自噬體形成(自噬抑制組)Fig.1 Effects on the autophagy formation by ESAT6-CFP10 fusion proteinA:Autophay induced by rapamycin after infection with MTB;B:Autophagy induced by rapamycin;C:Autophay inhibited by ESAT6-CFP10 fusion protein.D:Autophay inhibited by 3-MA

2.2 CFU檢測(cè) H37Rv菌株感染細(xì)胞裂解后,稀釋后接種于 7H10培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò) 21d培養(yǎng),計(jì)數(shù)CFU結(jié)果見(jiàn)圖 2。ESA T6-CFP10融合蛋白組H37Rv菌株CFU為6.68±0.69,而自噬誘導(dǎo)組組CFU為4.47±0.45,兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而自噬誘導(dǎo)組組的CFU指數(shù)最高,為7.13±0.57,結(jié)果說(shuō)明 ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬細(xì)胞后,干擾了自噬體對(duì)胞內(nèi)感染的 H37Rv菌株的清除作用。

2.3 atg mRNA表達(dá)水平 MTB感染后,自噬誘導(dǎo)組中atg5、atg8、atg12表達(dá)水平均高于雷帕霉素組,在 ESA T6-CFP10融合蛋白作用下 atg分子mRNA表達(dá)均下調(diào),其中尤以atg8分子mRNA表達(dá)水平下降最為明顯,見(jiàn)圖3,與自噬誘導(dǎo)組和雷帕霉素組相比均有顯著查差別(P<0.05),達(dá)到與自噬抑制組相同的水平。

2.4 atg5、atg8蛋白表達(dá)水平 分別以抗atg5多克隆抗體及atg8單克隆抗體與感染細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫印跡分析,結(jié)果如圖4所示,ESAT6-CFP10融合蛋白組和自噬抑制組中,無(wú)論是atg5蛋白還是atg8蛋白表達(dá)水平均明顯下降,而自噬誘導(dǎo)組和雷帕霉素組均無(wú)顯著變化。表明ESA T6-CFP10融合蛋白可能通過(guò)影響atg分子蛋白表達(dá)水平調(diào)控自噬體的形成。

圖4 免疫印跡分析atg5和atg8蛋白表達(dá)水平1:融合蛋白作用組;2:自噬抑制組;3:雷帕霉素組;4:自噬誘導(dǎo)組Fig.1 Expression of atg5 and atg8 detected by immuno blot1:ESAT6-CFP10 group;2:Autophayinhibited group; 3: Rapamycin group; 4:Autophagy induction group

3 討 論

越來(lái)越多的研究表明,胞內(nèi)感染病原體可以通過(guò)某些機(jī)制逃避機(jī)體的自噬[6]。例如,MTB可能通過(guò)自身分泌的某些蛋白,干擾自噬體與溶酶體的融合,抑制巨噬細(xì)胞中的自噬體不被降解。MTB抑制自噬體的形成可能是其免疫逃逸的機(jī)制之一。與減毒的疫苗株BCG相比較,MTB毒株能在巨噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活甚至大量繁殖;而非致病性的MTB在感染巨噬細(xì)胞后很快被巨噬細(xì)胞殺滅,提示毒力因子參與了對(duì)抗機(jī)體的防御機(jī)制。

我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中已觀察到ESAT6-CFP10融合蛋白能夠抑制巨噬細(xì)胞自噬體的形成[4],但未對(duì)巨噬細(xì)胞清除MTB毒株的能力進(jìn)行評(píng)價(jià),同時(shí)前期使用的自噬細(xì)胞模型缺乏雷帕霉素的誘導(dǎo),在巨噬細(xì)胞內(nèi)形成的自噬較少,缺乏典型性,因此本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中,除了MTB毒株感染巨噬細(xì)胞外,同時(shí)使用了雷帕霉素進(jìn)行誘導(dǎo),以期與蛋白干預(yù)組形成鮮明的對(duì)照,同時(shí)在檢測(cè)指標(biāo)中增加巨噬細(xì)胞中MTB的CFU計(jì)數(shù),進(jìn)一步量化巨噬細(xì)胞通過(guò)自噬清除MTB的能力。

cf p10和esat6均為 ESAT6/WXG-100超家族成員,僅存在于致病性分枝桿菌中,而在BCG及其它環(huán)境分枝桿菌中均缺失。這兩個(gè)基因受同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控,共同轉(zhuǎn)錄,分泌至體外形成緊密的1∶1蛋白復(fù)合物,在MTB的致病過(guò)程中具有重要作用,同時(shí)該融合蛋白能特異地與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合,從而調(diào)控宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答能力[7]。相對(duì)于單個(gè)ESAT6或CFP10蛋白來(lái)說(shuō),融合蛋白可提高這兩種蛋白的熱力學(xué)參數(shù)和生物學(xué)穩(wěn)定性。此外,在對(duì)該復(fù)合物的研究中還發(fā)現(xiàn),CFP10蛋白的羧基端氨基酸殘基對(duì)于維持 ESAT6的毒力是非常重要的,缺失CFP10蛋白后往往會(huì)導(dǎo)致 ESA T6毒力的下降,因此本研究選擇SAT6-CFP10融合蛋白作為毒力因子更具代表性。

本研究表明雷帕霉素可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生自噬體,當(dāng) H37Rv菌株感染巨噬細(xì)胞后,透射電鏡下可發(fā)現(xiàn)大量由單層膜組成的自噬囊泡,細(xì)胞中自噬體數(shù)目較多,加入 ESAT6-CFP10融合蛋白,可使巨噬細(xì)胞中自噬體數(shù)目明顯減少,表明 ESAT6-CFP10融合蛋白抑制了自噬體的形成。CFU檢測(cè)發(fā)現(xiàn),自噬體形成后可明顯降低小鼠巨噬細(xì)胞中的CFU計(jì)數(shù),有效清除胞內(nèi)感染的MTB,進(jìn)一步說(shuō)明ESAT6-CFP10融合蛋白可能抑制了自噬的形成,使得胞內(nèi)感染的MTB具有一定的免疫逃逸功能。在自噬體形成過(guò)程中,一些自噬相關(guān)基因的表達(dá),如atg5、atg7、atg8、atg12 等 ,對(duì)自噬體的形成至關(guān)重要,其中atg8分子表達(dá)的LC3蛋白是自噬形成的標(biāo)志物[8]。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明自噬形成后atg5、atg8及atg12表達(dá)量均上調(diào)。當(dāng) ESAT6-CFP10融合蛋白作用后,多種atg分子mRNA表達(dá)均下調(diào),特別是atg8分子下降最為明顯。atg5和atg8兩種分子的蛋白表達(dá)水平也同時(shí)下降,因此,推測(cè)在MTB感染過(guò)程中 ESAT6-CFP10融合蛋白通過(guò)影響atg分子的表達(dá)水平,特別是抑制atg8的表達(dá)調(diào)控自噬體的形成,這可能是 ESAT6-CFP10融合蛋白致病機(jī)理之一。

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