周 汛,楊致邦,肖異珠

申克孢子絲菌為一種雙相型真菌,25℃表現(xiàn)為菌絲相,37℃為酵母相,其酵母相可在感染者體內(nèi)組織增殖,形成小的芽生孢子而致病。申克孢子絲菌的雙相性表明該菌不同菌相存在差異表達基因,在不同的環(huán)境條件下,通過菌體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控,不同的基因表達,形成酵母相或菌絲相。目前申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換的相關(guān)研究僅涉及少數(shù)幾個基因[1-4],其雙相轉(zhuǎn)換的分子機制尚未完全明了,研究申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換機制對揭示其發(fā)病機理有重要意義。

本研究在應(yīng)用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了高特異性的申克孢子絲菌菌絲相(mycelium,M)和酵母相(yeast,Y)的正反cDNA消減文庫的基礎(chǔ)上,對差異表達基因進行生物信息學(xué)分析,以篩選出與雙相轉(zhuǎn)換相關(guān)的差異表達基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(F)D1a,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院南京皮膚病研究所。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒(Autolab,China);PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech,American);SMART cDNA Amplification Kit(Clontech,American);PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Autolab,China);T-載體連接試劑盒(Promega,American);質(zhì)粒提取試劑盒(Autolab,China);

1.1.3 引物和接頭序列(Clonetech PCR-Select cDNA Subtraction Kit提供)

接頭1:

接頭2R:

1.2 方法

1.2.1 菌絲相和酵母相細胞總RNA的提取 分別取孢子絲菌菌絲相(標(biāo)記M)和酵母相(標(biāo)記 Y)菌體約200mg,按植物總RNA提取試劑盒按說明書操作提取總RNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.2.2 cDNA的合成 分別取3μL M和 Y的總RNA為模板,按 SMART PCR cDNA Synthesis試劑盒說明書操作合成cDNA,主要過程為合成M、Y的cDNA第一鏈及第二鏈;去除cDNA短片段;RsaI酶切處理雙鏈cDNA。

1.2.3 抑制性消減雜交 按照PCR-Select cDNA Subt raction Kit說明書操作。分別以RsaⅠ酶切后的M、Y的cDNA為檢測子和驅(qū)動子,連接接頭1和和接頭2R,將檢測子與過量的驅(qū)動子混合后進行兩次雜交,雜交后的“M+Y”、“Y+M”再行兩輪抑制性PCR擴增;所得的二次 PCR產(chǎn)物利用 PCR purification kit進行純化。

1.2.4 cDNA消減文庫的構(gòu)建 按照Diatchenko L[5]參考文獻方法操作。

1.2.5 轉(zhuǎn)化重組子的篩選及單克隆檢測 挑取有插入片段的白色單克隆菌落,接種于含100mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中,37℃靜止培養(yǎng)5h;取1μL于96孔PCR反應(yīng)板內(nèi),利用消減雜交試劑盒中提供的巢式引物 PrimerT7和 PrimerSP6進行 PCR擴增,擴增產(chǎn)物電泳觀察插入的差異表達片斷的大小及分布范圍。

1.2.6 “M+Y”、“Y+M”文庫測序 在紫外透射儀上挑取插入片斷大于250bp、帶型單一的陽性克隆,以 T7或SP6為正向引物,用 ABI 9600測序儀進行單向測序,將所測序列,即表達序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,ESTs)進行生物信息學(xué)分析。

1.2.7 ESTs數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析 包括 ESTs數(shù)據(jù)預(yù)處理、EST數(shù)據(jù)的拼接和聚類分析、Unigene開放性讀碼框的預(yù)測、利用 NCBI Nt,NCBI Nr,SwissProt,KEGG,COG,InterPro及 GO數(shù)據(jù)庫對篩選的差異表達基因進行注釋和功能分類。

2 結(jié) 果

2.1 申克孢子絲菌菌絲相和酵母相正反cDNA消減文庫的構(gòu)建

2.1.1 申克孢子絲菌絲相(M)和酵母相(Y)總RNA的的鑒定 M和 Y RNA樣品經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外燈下觀察,均可見28S、18S、5.8S(5S)3條清晰的rRNA條帶,見圖1。

圖1 菌絲相及酵母相細胞總RN AFig.1 The total RNA isolated from yeast and Mycelium cells M:Mycelium Y:Yeast

2.1.2 申克孢子絲菌絲相(M)和酵母相(Y)cDNA合成:M、Y cDNA合成效果好,cDNA主要分布在0.5～2 kb,平均長度1 kb,呈長瀑布條帶,見圖2,圖3。

2.1.3 cDNA經(jīng)RsaI酶切效果檢測RsaI酶切前,M、Y樣品cDNA主要分布在0.5～2 kb,平均長度1 kb;酶切后片段明顯減小,平均500bp左右,見圖4。

2.1.4 接頭連接效率檢測 (Marker 1kb plus:10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,0.8kb,0.5kb,0.3kb)PCR結(jié)果示條帶彌散,與酶切完cDNA類似,提示接頭已連上,見圖5。

圖4 cDNA及 RsaI酶切電泳圖譜Fig.4 cDNA and cDNA ofRsaI digestedM:Marker 1kb plus;1,3:M,Y cDNA;2,4:M,Y cDNA ofRsaI digested

圖5 接頭連接PCR擴增圖譜Fig.5 Adaptor ligation amplified by PCRM:Marker 1kb plus;1:M+1;2:M+2;3:Y+1;4:Y+2

2.1.5 SSH產(chǎn)物的電泳鑒定 經(jīng)SSH消減后的cDNA片段較消減前分布區(qū)域明顯縮小,兩輪PCR擴增后平均片段長度為500-600bp左右,表明 cDNA得到了良好的均衡和消減,見圖6。

圖6 兩輪PCR電泳圖譜M:Marker 1kb plus;1:Y+M第一輪PCR產(chǎn)物;2:M+Y第一輪PCR產(chǎn)物;3:+M第二輪PCR產(chǎn)物;4:M+Y第二輪PCR產(chǎn)物Fig.6 PCR production after twice subtraction

2.1.6 第二輪PCR產(chǎn)物純化后濃度及純度 純化后的M+Y及 Y+M PCR產(chǎn)物濃度分別為:0.101 μg/μL,0.075μg/μL;OD260/280 分別為:1.78,1.70。提示cDNA純度較高,無蛋白質(zhì)、核酸及鹽類等污染。

2.1.7 消減文庫單克隆的PCR擴增 隨機挑取白色菌落進行 PCR擴增,鑒定陽性克隆插入片斷大小,插入片斷主要集中于400～1 000bp,見圖7。

2.1.8 “M+Y”、“Y+M”文庫測序及分析 M+Y文庫獲得751條ESTs,其中高質(zhì)量718條,低質(zhì)量28條,載體 ESTs5條。ESTs序列長度主要分布在600～1 000bp,平均690.95bp,帶載體序列的 ESTs長度主要分布在600～900bp,平均694.1bp;不帶載體序列的 ESTs長度主要分布在300～500 bp,平均為410.5bp。Y+M文庫獲得875條ESTs,其中高質(zhì)量809條,低質(zhì)量55條,載體 ESTs11條。ESTs序列長度主要分布在400～900bp,平均長度為575.9bp,帶載體序列的 ESTs長度主要分布在400～800bp,平均長度為 582.3bp,不帶載體序列的ESTs長度主要分布在300～600bp,平均長度為411.4bp。

圖7 消減文庫部分陽性克隆的PCR擴增結(jié)果Fig.7 Some samples amplified by PCRM:marker DL2000 Plus:250bp,500bp,800bp,1kb,2kb,3kb,4.5kb

2.2 ESTs數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 ESTs數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果 M+Y文庫的718條高質(zhì)量 ESTs經(jīng)過拼接組裝后,獲得52條序列重疊群(Contigs),49條單一序列(Singlets),共101條非冗余序列簇(Unigenes),占14.06%;Y+M文庫的809條高質(zhì)量ESTs經(jīng)過拼接組裝后,獲得109條 Contigs,140 條 Singlets,共 249 條 Unigenes,占30.77%(見表3)。M+Y文庫的101條 Unigenes平均長度為530.39bp,最大的由70個 ESTs組成,有 ORF的 Unigenes63條,占 62.4%,無 ORF的有38條,占37.6%;最長ORF的平均長度為186.19 bp。Y+M文庫的249條 Unigenes平均長度為499.28bp,最大的由 62個 ESTs組成,有 ORF的Unigenes194條 ,占 77.9%,沒有 ORF 的 55 條 ,占22.1%。最長ORF的平均長度為193.59bp。

2.2.2 Unigenes數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果 Blastn NCBI Nt:M+Y文庫的101條Unigenes有注解的共93條,占92.1%,其中有多個重復(fù)序列,去除重復(fù)序列后得到35條同源基因序列;Y+M文庫的249條Unigenes有注解的共232條,占93.21%,去除重復(fù)序列后得到91條同源基因序列。Blastx NCBI Nr:M+Y文庫有注解的共47條,占46.5%;Y+M文庫有注解的共 213條,占 85.5%。Blastx SWISSPROT:M+Y文庫有注解的共14條,占13.9%;Y+M文庫有注解的共61條,占24.5%。Blastx KEGG:M+Y文庫有注解的共34條,占33.7%;Y+M文庫有注解的共149條,占59.8%。COG分類:M+Y文庫有注解的共6條,占5.9%,其中,2條為轉(zhuǎn)錄后修飾,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶蛋白;氨基酸運輸和代謝的、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、一般功能預(yù)測及功能未知的各1條;Y+M文庫有注解的共27條,占18.5%,其中,8條為翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源;6條為能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換;轉(zhuǎn)錄:3條;碳水化合物運輸和代謝:3條;氨基酸運輸和代謝、脂質(zhì)運輸和代謝、輔酶的運輸和代謝、轉(zhuǎn)錄后修飾,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶蛋白、復(fù)制,重組和修復(fù)、一般功能預(yù)測及細胞骨架各1條;Interpro:M+Y文庫有注解的共10條,占9.9%;Y+M文庫有注解的共 42條,占16.9%。數(shù)據(jù)庫比對分析結(jié)果:M+Y文庫有注解的共9條,占8.9%;Y+M文庫有注解的共32條,占12.9%。

3 討 論

抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)[6]是一種以抑制性PCR反應(yīng)為基礎(chǔ),將標(biāo)準(zhǔn)化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的技術(shù)。該技術(shù)將待測的cDNA分為檢測子(tester)和驅(qū)動子(driver),標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度,消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)動子之間的共同序列,使差異表達序列得到擴增。SSH技術(shù)的本質(zhì)是除去共同的cDNA序列,有效富集差異表達基因的序列,故敏感性較高,在克隆差異表達基因方面得到廣泛使用[7-9]。該方法也應(yīng)用于部分致病性真菌的致病性和耐藥性的研究當(dāng)中,如曲霉、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌,白念珠菌等[10-12]。劉紅芳、席麗艷等應(yīng)用SSH技術(shù)構(gòu)建了馬內(nèi)菲青霉酵母相和菌絲相的消減cDNA文庫,并進行了差異表達基因的初步篩選[13]。

生物信息學(xué)(bioinformatics)[14]是生物學(xué)與計算機科學(xué)以及應(yīng)用數(shù)學(xué)等學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。它通過對生物信息的獲取、加工、存儲、檢索與分析,綜合運用數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)和生物學(xué)的各種工具,進而達到揭示數(shù)據(jù)所蘊含的生物學(xué)意義的目的。從已建好的cDNA庫中隨機取出一個,從5’末端或3’末端對插入的cDNA片段進行一輪單向自動測序,所獲得的一段短的cDNA部分序列,即為表達序列標(biāo)簽(EST)[15]。EST作為表達基因所在區(qū)域的分子標(biāo)簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特殊性質(zhì),能穿越家系與種的限制,容易在EST庫中搜尋到新的基因。

本研究是在成功構(gòu)建申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株酵母相和菌絲相差異表達cDNA文庫的基礎(chǔ)上進行生物信息學(xué)分析,對所有數(shù)據(jù)進行去載、拼接、聚類和Blastn分析及數(shù)據(jù)整理,M+Y文庫獲得101條Unigenes;Y+M文庫獲得249條Unigenes。這些拼接后得到的Unigenes序列通過與多個數(shù)據(jù)庫的比對分析,發(fā)現(xiàn)M+Y,Y+M兩個消減文庫中都出現(xiàn)有多個重復(fù)的基因序列,在兩輪PCR中也出現(xiàn)了幾條特異條帶,這幾個基因都多次重復(fù),從M+Y/Y+M兩者的比對結(jié)果來看,這些多次重復(fù)基因沒有在 Y+M/M+Y中出現(xiàn),表明這不是假陽性產(chǎn)生的,而是正常被消減出來的結(jié)果,理論上講重復(fù)序列的出現(xiàn)可能是樣本間表達差異大,差異豐度高的基因。申克孢子絲菌酵母相菌絲相的轉(zhuǎn)換伴隨著不同菌相細胞差異基因的高表達,這些高表達的差異基因可分為四類:(1)結(jié)構(gòu)基因類:如18S、25sRNA基因,某些結(jié)構(gòu)基因在申克孢子絲菌酵母相菌絲相狀態(tài)下的獨特表達,可能是菌相轉(zhuǎn)換的結(jié)果;(2)代謝酶類:參與碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)和輔酶運輸和代謝,環(huán)境的改變勢將影響細胞代謝的增強或代謝途徑的改變。(3)細胞表面分子類,這些分子參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),推測其在菌相轉(zhuǎn)換中起介導(dǎo)細胞基因表達的調(diào)控或細胞行為的改變;(4)功能不明的細胞分子。它們在申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換機制中的作用也有待進一步驗證,在已知這些基因全部或部分序列后對其功能及其與菌相轉(zhuǎn)換的關(guān)系進行更深入的研究顯得尤為重要。

另外,我們的試驗結(jié)果未能驗證已報道的與申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因。如:編碼鈣/鈣調(diào)蛋白激酶家族中的 SSCM K1基因sscmk1,其在GENEBAN K的編號是A Y823267.1;編碼胞漿磷脂酶A2的基因 ssg-2,其編號是A Y078408;細胞周期素依賴激酶的編碼基因 PhoSs,其編號是AF116453;PKC的編碼基因 pkcSs-1,其編號是AF12492.1。與M+Y及 Y+M cDNA差異基因文庫中的所有基因序列進行比對,沒有找到相同的基因。分析可能的原因為:1.雖然SSH技術(shù)的本質(zhì)是除去共同的cDNA序列,有效富集差異表達基因的序列,敏感性較高,但對差異豐度不顯著的基因可能不會全部被檢出;2.雖然在篩選出具有插入片段的克隆后進行了大規(guī)模的測序,仍然可能漏掉部分差異基因片段;3.對 ESTs進行拼接組裝后得到的unigene的序列可能不是完全準(zhǔn)確。所以,成功構(gòu)建申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株酵母相和菌絲相差異表達cDNA文庫及差異表達基因的生物信息學(xué)分析只是為進一步篩選與申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ),還需要針對篩選出的有意義的差異表達基因進行下游驗證試驗。

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