徐 娜,李寶玉,柳紀(jì)省

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱豬藍(lán)耳病,是由病毒引起的一種高度接觸性傳染病,可導(dǎo)致母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬嚴(yán)重的呼吸道癥狀及高死亡率。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長(zhǎng)約15kb,有8個(gè)不同程度的開放閱讀框(ORFS),即 ORF1-ORF7。該病毒具有3個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白,即 E蛋白,M蛋白和N蛋白,這3種蛋白分別由病毒基因ORF5,ORF6和ORF7編碼。其中E蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,有6個(gè)抗原決定簇,其中有一個(gè)是血清型特異性線性中和決定簇,能在豬體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,在體外可中和病毒的感染。此外,在PRRSV感染的巨噬細(xì)胞和干細(xì)胞中,E蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,參與病毒粒子結(jié)合病毒受體的過(guò)程。M蛋白在所有的PRRSV株間高度保守,其聚集于粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,并與 E蛋白形成異源二聚體。通過(guò)對(duì)感染豬康復(fù)血清的Western免疫印跡分析,M蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性,感染10d即可激發(fā)可檢測(cè)的抗體應(yīng)答[1-2],表達(dá)的重組M蛋白可以作為血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原[3]。N蛋白是一種堿性磷酸蛋白,自身以二硫鍵形成同源二聚體。N蛋白構(gòu)成病毒的主要抗原,免疫原性極強(qiáng),N蛋白有6個(gè)疏水區(qū)和5個(gè)抗原決定簇,包括對(duì)所有毒株保守的共同決定簇和北美型或歐洲型特異性決定簇[4],其主要的抗原決定簇主要分布在蛋白的中央。

目前控制PRRSV感染尚無(wú)特效藥物,生產(chǎn)中應(yīng)用的有弱毒疫苗和滅活疫苗,弱毒疫苗穩(wěn)定性差,安全和效力不可靠,易返強(qiáng)。滅活疫苗免疫劑量大、免疫次數(shù)多、免疫力產(chǎn)生期較長(zhǎng),不適合仔豬免疫。因此研制安全、穩(wěn)定、高效的新型PRRSV疫苗迫在眉睫。研究表明以腺病毒為表達(dá)載體的基因工程疫苗具有良好的應(yīng)用前景。腺病毒載體具有穩(wěn)定性、對(duì)外源DNA的高容量、宿主范圍廣以及可以產(chǎn)生高滴度后代等優(yōu)點(diǎn),在基因治療、基因工程疫苗的開發(fā)上具有廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)構(gòu)建了包含有E+M+N基因的腺病毒質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染293細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了病毒的包裝,為 PRRSV活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及載體 豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲毒株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng);PMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物(Takara)公司;大腸桿菌菌株JM109等為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室保存,腺病毒穿梭載體(pAdTrack-CMV)、人5型腺病毒骨架載體(pAdEasy-1)、大腸桿菌BJ5183、DH10B菌株購(gòu)于上海杰美生物技術(shù)公司。

1.2 主要試劑及工具酶 病毒總RNA提取試劑盒購(gòu)自promega公司;xbaI,HindⅢ,KpnI,xhoI等限制性內(nèi)切酶;反轉(zhuǎn)錄酶AMV,T4 DNA連接酶和 Taq DNA聚合酶,RNA酶抑制劑(RNAsin),DNA回收試劑盒,質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自大連寶生物(Takara)公司;PmeI,PacI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Biolab公司;脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM購(gòu)自 Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)合成 E基因5’和3’端分別帶有KpnI和xbaI限制性酶切位點(diǎn)的引物,分別命名為 E1和E2;合成 M基因5’和3’端分別帶有xbaI和HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)的引物,分別命名為M1和M2;同時(shí)設(shè)計(jì)合成N基因5’和3’端分別帶有HindⅢ和xhoI限制性酶切位點(diǎn)的引物,分別命名為N1和N2。引物序列如下:

1.4 PRRSV RNA的提取 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明,從細(xì)胞培養(yǎng)毒液中提取RNA。

1.5 目的基因的制備 將提取的總RNA分別用引物 E2、M2、N2,在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下于42℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。然后以 cDNA 為模板,E1、E2;M1、M2;N1、N2為引物分別擴(kuò)增 E、M和N基因。膠回收純化雙鏈cDNA,連接PMD18-T載體,分別篩選含 E、M和N基因片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒,分別命名為 PMD18-T/E,PMD18-T/M,PMD18-T/N,酶切和 PCR鑒定后送大連寶生物有限公司測(cè)序。

1.6 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建 將PMD18-T/E質(zhì)粒經(jīng)KpnI、xbaI雙酶切,PMD18-T/M質(zhì)粒經(jīng)xbaI、HindⅢ雙酶切,PMD18-T/N質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、xhoI雙酶切后形成帶有粘性末端的目的基因。同時(shí),將腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV經(jīng)KpnI、xhoI雙酶切得到線形化的載體。使用 T4 DNA連接酶對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行粘端連接。按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JM109,在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選,挑選克隆后,提取質(zhì)粒。采用酶切、PCR擴(kuò)增等方法鑒定,得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒,命名為pAdTrack-CMV/E+M+N。

1.7 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 將骨架載體pAdEasy-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183,制備攜帶腺病毒骨架載體的感受態(tài)菌。將重組穿梭載體pAdTrack-CMV/E+M+N經(jīng)PmeI線形化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌,電轉(zhuǎn)后將細(xì)胞在LB培養(yǎng)液中37℃復(fù)蘇1h,取適量的細(xì)胞涂入含50mg/mL卡那霉素的培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)16～20h,挑選卡那抗性克隆,小量提取質(zhì)粒DNA,用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析,并進(jìn)行酶切圖譜分析。將所得的重組腺病毒質(zhì)粒以上述同樣條件電轉(zhuǎn)入宿主菌DH10B,在此宿主菌內(nèi)可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒,挑選目的克隆,命名為pAd/E+M+N。

1.8 轉(zhuǎn)染 HEK-293細(xì)胞獲得重組腺病毒 從含有pAd/E+M+N質(zhì)粒的DH10B菌液中提取重組腺病毒質(zhì)粒4μg,PacI酶切線性化,乙醇沉淀滅菌,超純水溶解沉淀,用脂質(zhì)體Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.9 病毒的傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞病變明顯時(shí),收集并離心收獲細(xì)胞,棄上清,用約500μL的 PBS重懸細(xì)胞,37℃/-70℃反復(fù)凍融3次,12 000r/min離心10min,棄沉淀,將上清轉(zhuǎn)入一新的1.5mL的離心管中,保存于-70℃,此即為初代重組腺病毒。

1.10 重組腺病毒的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4、6、8、10代病毒上清20μL,加入蛋白酶 K于 56℃作用 1h,取 2μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測(cè)重組病毒的穩(wěn)定性。

1.11 重組腺病毒的 TCID50的測(cè)定 待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿之后,用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基10倍系列稀釋第10代病毒液從10-2至10-11,每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔,每孔接種100μL病毒稀釋液。同時(shí)設(shè)定兩排孔用維持液做對(duì)照。37℃5%CO2溫箱培養(yǎng)3～7d,計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度細(xì)胞的病變孔數(shù)。并按 Reed-Muench法計(jì)算病毒 TCID50。計(jì)算公式如下:

距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))

1g TCID50=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 目的基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析表明,分別擴(kuò)增出與 E、M和N基因相應(yīng)的約671bp,532bp,414bp大小的特異片段見圖1。

2.2 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建 將所獲得的含有E、M和N基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒分別用KpnI和xhaI雙酶切,xbaI和HindⅢ雙酶切,HindⅢ和xhoI雙酶切后,釋放出來(lái)的片段分別與 E、M、N基因相符見圖2A,PCR鑒定也出現(xiàn)同樣大小的片段見圖2B,證明重組腺病毒穿梭載體已構(gòu)建成功。

2.3 獲得復(fù)制缺陷型腺病毒質(zhì)粒 將重組穿梭質(zhì)粒線性化后,電轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌,挑取陽(yáng)性克隆,小量提取質(zhì)粒,0.8%瓊脂糖凝膠電泳,可見重組腺病毒質(zhì)粒與pAdEasy-1大小相似。限制性內(nèi)切酶酶切后可見約4.5kb和33kb的條帶,其結(jié)果與預(yù)期相符見圖3。

2.4 重組腺病毒的鑒定 將PacI酶切線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)良好的低代次293細(xì)胞,可產(chǎn)生重組腺病毒。用此重組腺病毒再次感染低代次293細(xì)胞,3～5d后可見細(xì)胞病變(CPE),病變細(xì)胞腫脹、變圓、聚集,部分病變細(xì)胞脫落見圖4,與正常細(xì)胞比較,可見明顯的病變。

2.5 重組腺病毒的穩(wěn)定性試驗(yàn) 將病變的細(xì)胞連續(xù)傳至4、6、8、10代,分別提取各代細(xì)胞的總DNA,以此為模板進(jìn)行外源基因的PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示每代細(xì)胞提取的DNA都能擴(kuò)增出目的基因,說(shuō)明重組腺病毒能夠穩(wěn)定遺傳。

2.6 重組腺病毒的 TCID50測(cè)定 將第10代重組腺病毒傳代細(xì)胞做接毒處理,6d后可明顯觀察到細(xì)胞病變的情況見圖5,將病變細(xì)胞做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)可知重組腺病毒的 TCID50為1.5×107。

圖5 接毒后產(chǎn)生病變的 HEK-293細(xì)胞Fig.5 Lesions resulting from inoculation to HEK-293 cell

3 討 論

3.1 活載體疫苗應(yīng)用動(dòng)物病毒弱毒或無(wú)毒株如痘苗病毒、瘡疹病毒、腺病毒等作為載體,插入外源抗原基因構(gòu)建重組活病毒載體,轉(zhuǎn)染病毒細(xì)胞而產(chǎn)生的。它避免了PRRS滅活疫苗和弱毒疫苗的缺陷,可同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫,而且還可構(gòu)建多價(jià)疫苗,活載體疫苗成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。Jiang等[5]構(gòu)建了表達(dá) PRRSV修飾的 GP5和M融合蛋白的重組偽狂犬病病毒rPRV-GP5m-M,試驗(yàn)結(jié)果表明,重組疫苗 rPRV-GP5m-M免疫豬產(chǎn)生了PRRSV特異性中和抗體和高水平的淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明,重組疫苗免疫豬產(chǎn)生的體溫變化不明顯,出現(xiàn)了短期的病毒血癥,在鼻和口咽刮取物以及組織中的病毒含量較低。表明重組偽狂犬病病毒rPRV-GP5m-M對(duì)預(yù)防PRV和PRRSV感染可能是一個(gè)比較理想的候選疫苗。據(jù)報(bào)道以偽狂犬病毒基因缺失標(biāo)志疫苗株 TK-/gG-/LacZ+為親本株,通過(guò)同源重組,構(gòu)建了表達(dá)PRRSV主要免疫原性蛋白GP5的重組偽狂犬病毒TK/gG/GP5+,將重組病毒免疫Balb/c小鼠,經(jīng)過(guò)2次免疫后,有50%的小鼠產(chǎn)生了 GP5特異性ELISA抗體。

3.2 腺病毒載體具有宿主范圍廣,對(duì)人致病性低;在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因;基因組相對(duì)穩(wěn)定;能有效進(jìn)行增殖,滴度高;與人類基因同源;不整合到染色體中,無(wú)插入致突變性;能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增;能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)建重組腺病毒工作中的限速步驟是將目的基因整合入腺病毒基因組中。以前大都是將外源基因插入以質(zhì)粒形式存在的腺病毒穿梭載體上,而后用真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒間同源重組的方式得到重組腺病毒。這種方法雖然有效,但同源重組效率低,不能完全避免野生型病毒的產(chǎn)生,需進(jìn)行噬斑純化,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建重組腺病毒顯示了優(yōu)越性。

3.3 本試驗(yàn)從PRRSV毒株中分別擴(kuò)增E、M和N基因,并在三者之間導(dǎo)入2A序列,使一個(gè)閱讀框同時(shí)表達(dá)三種不同的免疫蛋白,避免了融合表達(dá)對(duì)蛋白活性的影響。然后將外源基因定向插入到腺病毒穿梭載體中,經(jīng)過(guò)大腸桿菌內(nèi)同源重組獲得重組復(fù)制缺陷性腺病毒,由于pAdTrack-CMV含有 GFP基因,同源重組后能在293細(xì)胞中大量表達(dá) GFP,可在熒光顯微鏡下檢測(cè)到熒光蛋白基因 GFP。最后經(jīng)過(guò)病變的觀察,證明基因能夠穩(wěn)定的表達(dá),從而為豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制缺陷型腺病毒活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

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