吉芳坤 ,李中杰 ,邱海燕,肖玉春,景懷琦,段廣才,王 鑫

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病是一種新的腸道傳染病,呈世界性分布,是歐洲一些國家腹瀉的主要病原,這些地區(qū)耶爾森菌引起的胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉比痢疾還多。1981年我國發(fā)現(xiàn)此病后,開展過全國性調(diào)查研究,分別從人群、動(dòng)物和外環(huán)境分離出病原菌,證明耶爾森菌在我國的分布非常廣泛[1]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染已經(jīng)成為一個(gè)危害公眾健康的嚴(yán)重問題,尤其與兒童腸道疾病密切相關(guān),主要系通過與感染動(dòng)物糞便接觸或攝取被污染的食物感染,人類感染耶爾森菌后可表現(xiàn)出一系列不同癥狀,如:腹瀉、腸系膜淋巴結(jié)炎、假闌尾炎、慢性回腸炎,嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥[2]。

組織侵襲和細(xì)胞內(nèi)寄生是致病菌毒力機(jī)制的重要特征,尤其對于腸道致病菌來說顯得更加重要[3]。目前已在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌中確定了3種侵襲相關(guān)基因:侵襲素基因(invasin,inv),粘附侵襲位點(diǎn)基因(attachment invasion locus,ail)和耶爾森菌粘附素A基因(yadA)。inv和ail基因都是在染色體上編碼的,而yadA基因是由耶爾森菌的毒力質(zhì)粒編碼[4-5]。耶爾森菌的侵襲性主要還是由染色體基因決定的,因?yàn)楫?dāng)菌株的毒力質(zhì)粒丟失時(shí)仍然具有侵襲性,而將毒力質(zhì)粒轉(zhuǎn)入非致病菌株后,并不能賦予其侵襲粘附的功能[6]。黃瑛等人通過對中國地區(qū)271株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和12株參考株的ail基因進(jìn)行序列分析,將ail基因序列分為3種序列型:高致病株(1b/O∶8)來源的A2型;低致病株(2/O∶9)來源的A1型;新發(fā)現(xiàn)序列型 A3型。分離自寧夏地區(qū)的致病株IE419(2/O∶9)單獨(dú)形成的A3型有可能是A1型的突變株,其核酸序列已提交到 GenBank,序列號(hào)為 GU72220[7]。為確定新發(fā)現(xiàn)A3序列型ail基因在粘附侵襲能力上是否出現(xiàn)改變以及不同序列型ail基因的粘附侵襲功能是否存在差異,我們將3種序列型ail基因轉(zhuǎn)入非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,通過體外組織粘附侵襲實(shí)驗(yàn)和其他分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株標(biāo)本 代表3種不同序列型ail基因的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌:A2型代表菌株 Ye92010(1b/O∶8);A1型代表菌株 HA8629(2/O∶9);A3型代表菌株 IE419(2/O∶9)。Ye92010是從一名日本臨床腹瀉病人糞便標(biāo)本中分離出的致病株;HA8629是在中國河南地區(qū)從腹瀉病人標(biāo)本中分離出來的致病株;IE419則是從中國寧夏地區(qū)鼠中分離出來的致病株。Y40是在中國江蘇地區(qū)豬中分離出來的非致病株,為1A/O∶8生物血清型。

1.1.2 組織細(xì)胞 HEp-2細(xì)胞,人類喉癌上皮細(xì)胞;HT-29細(xì)胞,人類結(jié)腸癌上皮細(xì)胞。均來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 質(zhì)粒,感受態(tài)細(xì)胞 克隆質(zhì)粒pMD18-T和JM109感受態(tài)細(xì)胞均購自 TaKaRa公司。質(zhì)粒pMD18-T結(jié)構(gòu)圖見圖1。

1.1.4 引物合成和DNA測序 引物以O(shè)∶8血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的ail基因核酸序列為參考設(shè)計(jì)。重組質(zhì)粒DNA測序由大連(寶生物)公司完成。

圖1 pMD18-T質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of vectorpMD18-T

1.2 方法

1.2.1ail基因的克隆表達(dá) 根據(jù)已獲得的O∶8血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的ail基因的編碼序列設(shè)計(jì)引物:

通過PCR擴(kuò)增3種不同代表菌株 Ye92010(1b/O∶8)、HA8629(2/O∶9)、IE419(2/O ∶9)的ail基因,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選陽性克隆,將經(jīng)鑒定正確連接的重組質(zhì)粒通過高壓電穿孔儀轉(zhuǎn)入非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 Y40?？寺【杲?jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,制備成電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2 體外組織細(xì)胞粘附侵襲實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)至單層細(xì)胞的HEP-2和 HT-29細(xì)胞以0.25%胰酶(Hyclone)消化后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)適度稀釋使其濃度約為1.0×105cfu/mL。稀釋后的細(xì)胞懸液在24孔細(xì)胞板中再次培養(yǎng)至單層細(xì)胞后以PBS清洗,分別加入800μL不含抗生素的MEM和1640培養(yǎng)液,并加入200μL預(yù)先備好的菌液(2.0×107cfu/mL)。作用4.5h后,以0.5%脫氧膽石酸鈉充分裂解細(xì)胞以釋放粘附在細(xì)胞表面和侵入到細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)菌。將裂解液適度稀釋后涂板計(jì)數(shù),并對初始菌量也進(jìn)行計(jì)數(shù)。粘附效率以如下表示:涂板計(jì)數(shù)剩余的菌落數(shù)/初始菌量×100。涂板計(jì)數(shù)剩余的菌落數(shù)包括細(xì)胞周圍粘附的細(xì)菌和侵入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。同樣地,侵襲效率可以如下公式表示:慶大霉素處理后剩余菌落數(shù)/初始菌量×100[8-9]。將作用4.5h后的細(xì)胞以 PBS清洗后,分別加入含慶大霉素(20μg/mL)的 MEM和 1640培養(yǎng)液,再次培養(yǎng)4h之后可由上述公式計(jì)算出其侵襲效率。

1.2.3 顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征分析 被感染細(xì)胞以 PBS清洗后固定,Giemsa染液染色后,通過倒置顯微鏡(Olympus)觀察不同菌株對細(xì)胞的粘附侵襲狀況,放大倍數(shù)為10×40。

1.2.4 RT-PCR 提取各致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和克隆菌株的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆菌株中的ail基因是否在受體菌中成功轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié) 果

2.1ail基因的克隆表達(dá)

2.1.1 原核重組質(zhì)粒的鑒定 對獲得的克隆菌株進(jìn)行PCR鑒定,顯示各克隆菌株在1000bp左右的位置有一清晰的條帶,與目的基因的大小基本相符,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖2。送往 TA KARA公司測序后顯示序列連接正確,實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的克隆菌株見表1。

圖2 PCR擴(kuò)增目的片段 ail基因1-Marker依次為:Ye92010、HA8629、IE419、Y40、Y40-Y、Y40-H、Y40-I、陽性對照、MarkerFig.2 Amplification of the strains by PCR

表1 實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的重組克隆菌株Table 1 Recombinant colonies constructed in this study

2.1.2 RT-PCR 提取小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和克隆菌株的總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成DNA,并以DNA為模板擴(kuò)增而來的各PCR產(chǎn)物為陽性對照,確定克隆菌株中的ail基因成功轉(zhuǎn)錄。結(jié)果見圖3。

2.2 組織細(xì)胞粘附侵襲實(shí)驗(yàn):ail基因可以使原先無粘附侵襲特性的大腸桿菌表現(xiàn)出粘附侵襲的功能[10-11],因而ail基因序列的多態(tài)性可能會(huì)對其粘附侵襲功能產(chǎn)生影響,分別檢測3種類型陽性克隆菌株對HEP-2 and HT-29細(xì)胞粘附侵襲特性。結(jié)果見表2。

圖3 RT-PCR擴(kuò)增目的片段 ail基因1-Marker依次為:Ye92010、HA8629、IE419、Y40、Y40-Y、Y40-H、Y40-I、Ye92010(2)、空白對照、MarkerFig.3 Amplification of the strains by RT-PCR

表2 重組克隆菌株對組織細(xì)胞的粘附性和侵襲性Table 2 Adhesion and invasion of recombinant strains to cultured cells

上表數(shù)據(jù)經(jīng)spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,結(jié)果顯示:3種類型的克隆菌株在獲得致病性菌株中的ail基因后,未表現(xiàn)出粘附侵襲的能力,且其固有的非特異性粘附功能出現(xiàn)了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降。進(jìn)一步做侵襲性實(shí)驗(yàn)后,顯示陽性對照 Ye92010、HA8629、IE419,陰性對照 Y40,Y40轉(zhuǎn)化克隆菌株3組之中克隆菌株與陰性對照之間無差異,兩組數(shù)據(jù)與陽性對照間均存在明顯差異。這說明將ail基因轉(zhuǎn)入已證實(shí)無粘附侵襲性的非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后,對其侵襲特性無明顯影響,但卻降低了其粘附效能。且觀察3個(gè)陽性對照的數(shù)據(jù),可發(fā)現(xiàn)HA8629的菌落侵襲水平明顯高于 Ye92010和IE419,可能 HA8629是抗慶大霉素的耐藥株。

2.3 顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征分析 鏡下觀察不同菌株對細(xì)胞的粘附侵襲作用,見圖4。

由下圖可觀察到:Ye92010細(xì)菌延細(xì)胞邊緣走向清晰可見,排列成鏈狀或桿狀,HA8629、IE419鏡下排列形態(tài)與 Ye92010基本一致,但是菌量較少。非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陰性對照株 Y40背景清晰,菌少見。3種重組克隆菌株與非致病性陰性對照菌株 Y40保持一致,形態(tài)學(xué)上無差異。

3 討 論

ail基因的核酸序列包含一個(gè)536bp的開放讀碼框架(ORF),編碼一條由178個(gè)氨基酸組成的多肽,分子量為19 548Da[12]。此蛋白可以賦予小腸結(jié)腸炎耶爾森菌侵入上皮細(xì)胞的能力。體外組織侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,依據(jù)細(xì)胞種屬的不同,Ail蛋白侵入細(xì)胞的能力有一定程度的差異,但是都可以較高水平的顯示粘附的特性[8]。此外,還具有血清抵抗能力[10]。目前研究已經(jīng)證實(shí)粘附侵襲位點(diǎn)基因(ail),只存在于流行病學(xué)上與疾病相關(guān)的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,而inv基因在耶爾森菌屬其他種中也存在,這種結(jié)果顯示ail基因可能在致病機(jī)制中起到更重要的作用,假結(jié)核耶爾森菌inv突變株感染小鼠模型證實(shí)了這種猜想[11]。來自高致病株8081c(1b/O∶8)的ail基因的轉(zhuǎn)入可以賦予大腸桿菌粘附侵襲上皮細(xì)胞的功能,并且克隆菌株抵抗血清殺傷的能力可以達(dá)到大腸桿菌本菌的100倍以上[13]。

圖4 不同菌株對 HEp-2細(xì)胞的粘附侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The invasion and adherence assays of the different strains to HEp-2 cellA:Ye92010,B:HA8629,C:IE419,D:Y40,E:Y40-Y,F:Y40-H,G:Y40-I

大部分流行病學(xué)上與疾病無關(guān)的非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均缺乏對組織細(xì)胞的粘附侵襲作用[5,14]。曾有學(xué)者對轉(zhuǎn)入ail基因后的非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的侵襲性進(jìn)行過研究,將有功能的ail基因整合到致病性ail突變菌株或E.coli菌株時(shí)均可以賦予受體菌侵襲的表型,而轉(zhuǎn)入非致病性菌株中時(shí)并無相應(yīng)的功能表型,其認(rèn)為大腸桿菌與非致病性小腸結(jié)腸耶爾森的細(xì)胞背景不同,推測在非致病性菌株中可能缺乏一種和Ail蛋白協(xié)同作用的因子[10],同時(shí),因?yàn)閍il基因只存在于致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,在非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中缺乏ail基因的同源序列[8],轉(zhuǎn)化后致病性ail突變菌株侵襲功能的重現(xiàn)和非致病性菌株中侵襲功能的持續(xù)缺失意味著在非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌表面結(jié)構(gòu)上可能存在著某種影響重組Ail蛋白與組織細(xì)胞作用的因素,最終導(dǎo)致了克隆菌株中侵襲功能的不表達(dá)。而對于本次試驗(yàn)中克隆菌株非特異粘附效能的降低,有可能是ail基因的轉(zhuǎn)入改變了非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌膜表面某些介導(dǎo)非特異性粘附功能的因子的表達(dá)或者重組Ail蛋白對非致病耶爾森菌表面介導(dǎo)非特異性粘附功能的因子產(chǎn)生了影響,而出現(xiàn)了整體非特異粘附效能的下降,在侵襲功能上兩者則保持了一致性。因?yàn)橐疇柹鷮C(jī)體細(xì)胞的侵襲是一個(gè)分為粘附和侵襲的兩步過程,侵入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌是先通過粘附作用與細(xì)胞相互影響進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與細(xì)胞外細(xì)菌共同作用致機(jī)體患病的[12]。以ail基因突變菌株感染小鼠后,檢測病原菌向 Peyer結(jié)和其他組織器官遷移以及引起致死性感染的能力,結(jié)果顯示,突變株沒有產(chǎn)生可檢測到的Ail蛋白,與野生株相比對CHO細(xì)胞的侵襲作用降低[15];Ail蛋白在感染疾病的早期,也就是粘附侵襲階段起著重要的作用[8,10,15]。感染初期,介導(dǎo)的黏附表型的ail基因的缺失,有可能是非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病毒力缺失的一個(gè)重要因素。

綜上所述,3種不同序列型ail基因轉(zhuǎn)入非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后,并未賦予其粘附侵襲的功能,有待于進(jìn)一步研究分析3種序列型ail基因在粘附侵襲功能上的差異。但在本次研究中關(guān)于非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌ail基因轉(zhuǎn)化克隆菌株的粘附性能反常性降低的發(fā)現(xiàn),將有助于我們更加明確致病性耶爾森菌與宿主細(xì)胞之間的相互作用,闡明其粘附侵襲機(jī)制及致病機(jī)理。

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