吳蓓蓓,俞 盈,金培婕,方維煥

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是常見的食物中毒病原菌,它在浙江省細菌性食物中毒中占60%～70%[1]。近年來,副溶血性弧菌食物中毒的發(fā)生率呈上升趨勢[2],而且,隨著食物中毒分離菌耐藥性顯示,細菌對常用抗菌藥物逐漸產(chǎn)生耐藥性,這些情況不僅嚴重威脅人類健康,還危害海水養(yǎng)殖業(yè),給經(jīng)濟帶來巨大損失。耐熱直接溶血素(TDH)和 TDH-相關溶血素(TRH)被認為是副溶血性弧菌主要致病因子[3]。一般臨床分離株均可產(chǎn)生與 TDH有關[4]的神奈川現(xiàn)象,而環(huán)境分離株很少呈現(xiàn) KP陽性,但只要攜帶tdh或trh基因就可認為是毒力株[3]。部分副溶血性弧菌臨床分離株產(chǎn)生引起乳鼠腸液蓄積的尿素酶[5],ureC基因是尿素酶基因簇中最穩(wěn)定的結構基因。近期,研究發(fā)現(xiàn)另外的毒力因子——Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS),T3SS與細胞毒性和腸毒性有關[6],T6SS與霍亂弧菌的致病性有關[7],但其究竟是否貢獻副溶血性弧菌的致病力以及在副溶血性弧菌中的分布情況如何,還有待進一步的研究。

四環(huán)素類藥物被美國CDC推薦[8]為弧菌嚴重感染時首選抗菌藥物,其替代治療方案是聯(lián)合使用廣譜頭孢菌素類藥物和多西環(huán)素或單獨使用氟喹諾酮類藥物,不允許使用多西環(huán)素及氟喹諾酮類藥物的兒童可使用復方新諾明及氨基糖苷類藥物。但是隨著抗菌藥物的廣泛使用及濫用,越來越多副溶血性弧菌分離株顯示對以上藥物耐藥,這為副溶血性弧菌感染的治療帶來極大困難,威脅人類健康。

本研究對浙江寧波地區(qū)海產(chǎn)品和養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血性弧菌分離株進行主要毒力相關基因、毒力表型及抗菌藥物敏感性與耐藥基因檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2007年,赴寧波地區(qū)海產(chǎn)品養(yǎng)殖場進行系統(tǒng)的樣品采集,收集樣本115份,包括魚類、貝類、南美白對蝦與蟹類等經(jīng)濟海產(chǎn)品及養(yǎng)殖塘底泥和水。按國標法進行細菌分離[9]。經(jīng) PCR鑒定的90株副溶血性弧菌由本實驗室保存;參考株ZS91、J R1由實驗室保存;質(zhì)控菌大腸埃希氏菌ATCC 25922由中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥理及毒理研究室惠贈。

1.1.2 試劑Taq酶、10×PCR buffer、4×dNTP均購自北京鼎國生物技術有限責任公司;堿性蛋白胨水、TCBS瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋生物技術有限公司;莪妻氏瓊脂培養(yǎng)基、尿素酶瓊脂基礎購自中國進出口商品檢驗技術研究所北京陸橋技術有限責任公司;抗菌藥物標準品購自Sigma公司。

1.2 神奈川溶血試驗將供試菌株在含3%NaCl的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取10μL培養(yǎng)液加在莪妻氏瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,判定是否呈β溶血。

1.3尿素酶試驗 為提高檢測效率,采用96孔板細菌培養(yǎng)法檢測尿素酶表型。將供試菌株接種到含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)10 h,取20μL培養(yǎng)液于尿素酶瓊脂培養(yǎng)基(96孔培養(yǎng)板)中,每孔加入100μL滅菌的液體石蠟,培養(yǎng)24 h,觀察培養(yǎng)基是否變色,呈玫瑰紅色為陽性。

1.4 細菌基因組DNA的提取 參照Abolmaay改良方法[10]提取供試株細菌基因組DNA備用。

1.5 副溶血性弧菌主要毒力基因及耐藥基因的PCR擴增 采用本實驗室建立的各種毒力基因PCR檢測體系,所用引物見表1。主要毒力基因及耐藥基因的擴增均在30μL反應體系中進行,含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2,0.16 mmol/L dNTPs,0.83μmol/L相應引物,47 U/mlTaq酶及3.3μL模板DNA。擴增條件為:95℃5 min;94℃45 s,58℃40 s,72℃50 s,30個循環(huán) ;72℃10 min。trh基因采用巢式PCR法擴增,其中取1μL第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板,擴增條件均為:94℃3 min;94℃1 min,58℃50 s,72℃50 s,30個循環(huán);72℃5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在凝膠成像系統(tǒng)下拍照成像。

1.6 副溶血性弧菌抗菌藥物敏感性試驗 將WHO推薦的肉湯微量稀釋法進行改進,在96孔細菌培養(yǎng)板上進行倍比稀釋,提高試驗效率。判斷標準參照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)標準[11]。每種藥物兩個平行,以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌。

2 結 果

2.1 副溶血性弧菌毒力表型及毒力相關基因檢測結果

2.1.1副溶血性弧菌的溶血與尿素酶表型 90株副溶血性弧菌分離株中,KP現(xiàn)象除兩株為陽性外其余均陰性,神奈川溶血試驗部分結果見圖1。尿素酶試驗結果顯示,在90株副溶血性弧菌分離株中尿素酶表型陽性僅有2株(2.2%),尿素酶試驗部分結果見圖2。

圖1 副溶血弧菌環(huán)境分離株在莪妻氏培養(yǎng)基上呈現(xiàn)β-溶血環(huán)Fig.1 V.parahaemolyticusisolates from environment showed clearβ-hemolysin zone on Wagatsuma agar medium

2.1.2 毒力相關基因檢測 對海產(chǎn)品和環(huán)境分離株的毒力基因進行了檢測,90株分離株中,tdh、trh和ureC基因陽性株率分別為 2.2%、20%和12.2%,tdh+-trh+菌株占 1.1%。在 2株tdh+菌株中,未擴增到vscC2基因,在17株tdh--trh+菌株中亦未檢測到vscC2基因,所有菌株中均未擴增到vscD2基因,只在61.1%(11/18)的trh+菌株中擴增出ureC基因,Ⅵ型分泌系統(tǒng)vp1408的檢出率為17.8%。

表1 PCR反應引物對、預擴增片段長度列表Table 1 List of PCR primers and amplicon sizes

圖2 尿素酶表型圖示Fig.2 Urease test of severalV.parahaemolyticus

2.2 副溶血分離菌體外抗菌藥物敏感性試驗 采用肉湯微量稀釋法,對寧波分離的90株副溶血性弧菌復蘇進行20種抗菌藥物的藥物敏感性試驗,其中2株分離株未復蘇成功,結果見表2。所有分離菌對氟喹諾酮類(諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星)、氯霉素類(氯霉素、氟苯尼考)和四環(huán)素類藥物敏感。對其他種類抗生素均呈不同程度的耐藥,總體而言,超過95%的細菌對青霉素類、磺胺類藥物耐藥,對氨基糖苷類中鏈霉素和卡那霉素耐藥率分別為72.7%和88.6%,對其他抗生素的耐藥率相對較低。因此,寧波地區(qū)發(fā)生副溶血性弧菌感染時應盡量避免使用磺胺類藥物、卡那霉素及鏈霉素,可選擇性使用四環(huán)素類藥物、氟喹諾酮類藥物及氨基糖苷類藥物中的阿米卡星或慶大霉素等。

88株副溶血性弧菌對20種抗菌藥物多重耐藥情況見圖3。從圖中可以看出,副溶血性弧菌的多重耐藥情況比較嚴重,無對20種藥物都敏感的菌株和單藥耐藥菌株,最多耐藥10種,最少耐藥2種,6耐以上的超過82%。其中,耐磺胺類藥物的細菌占100%,耐磺胺類、青霉素類藥物的有83株細菌,占所有菌株的94.3%,沒有對磺胺類、頭孢類、氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物均耐藥的菌株,但對磺胺類、頭孢類和氨基糖苷類耐藥的80株,占所有菌株的90.9%,同時對氟喹諾酮類、氨基苷類、青霉素類、頭孢類、磺胺類等都產(chǎn)生耐藥性的耐藥譜也存在。

2.3 副溶血性弧菌主要耐藥基因檢測結果 實驗室建立了副溶血性弧菌主要耐藥基因的檢測體系,對寧波地區(qū)海產(chǎn)品和環(huán)境的副溶血性弧菌分離株磺胺類、頭孢類、氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物的主要耐藥基因進行檢測,部分結果見圖4。88株分離株耐藥基因的普查顯示,四環(huán)素類耐藥基因tetB的檢測率為0,頭孢類耐藥基因bla T EM的攜帶率為91.7%,磺胺類sul2和氨基糖苷類strB的檢測率分別為16.7%和43.3%;其中,均不攜帶這4種耐藥基因的分離菌有1株,至少攜帶1種耐藥基因的46株,占52.2%,攜帶2種和3種耐藥基因的分別占36.4%(32株)和10.2%(9株)。

表2 寧波88株副溶血弧菌對抗菌藥物敏感性試驗Table 2 Antimicrobials susceptibility tests ofV.parahaemolyticusisolates from Nningbo

圖3 寧波地區(qū)副溶血弧菌對20種藥物的多重耐藥情況Fig.3 Multi-drug resistance to Vibrio parahaemolyticus isolates from sea-foods and environment in Ningbo

圖4 部分副溶血弧菌海產(chǎn)品及環(huán)境分離株主要耐藥基因的PCR檢測A:sul2 andstrB基因電泳圖M:DL2000 Marker;1:1:ZS91對照;2-11:部分檢測樣本;B:tetB and bla TEM g基因電泳圖 M:DL2000;1:JR1對照;2-11:部分檢測樣本Fig.4 PCR identification of antibiotics resistance genes in several representativeV.parahaemolyticusisolatesA:sul2 andstrB genes M:DL2000;Lanes 1:ZS91;2-11:sea-foods and environment samples;B:tetB and bla TEM genes M:DL2000;Lanes 1:JR1;2-11:sea-foods and environment samples

3 討 論

本實驗室對浙江省沿海地區(qū)副溶血性弧菌的普查結果顯示該菌廣泛存在于海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境中,2007年寧波地區(qū)的檢出率達87%,從88株副溶血性弧菌環(huán)境分離株毒力相關基因檢出情況來看,3個主要毒力基因tdh、trh和ureC的攜帶率分別達到2.2%、20%和12.2%,且有1株同時攜帶這3種基因,攜帶率與國外報道基本一致[12-13]。此外,所有檢測菌株tdh基因型與 KP溶血表型一致,tdh-菌株的溶血表型陰性;2株tdh+的分離株 KP溶血表型陽性。tdh和 KP陽性菌株未檢測到 T3SS2基因簇中外膜蛋白基因vscC2,亦未檢測到內(nèi)膜蛋白基因vcrD2,這與國外研究人員Makino等[6]提出的T3SS2存在于 KP陽性副溶血性弧菌中的觀點不符,現(xiàn)象提示 T3SS2在海產(chǎn)品及環(huán)境分離株與臨床株之間的基因結構可能存在差異,這種差異及其相關基因的功能本實驗室正在進一步研究。在18株trh+分離株中只有 11株攜帶尿素酶結構基因ureC,但11株trh+-ureC+菌株并未顯示尿素酶陽性,而2株尿素酶陽性的細菌亦未攜帶trh或ureC基因,結果說明菌株是否攜帶trh或ureC基因與其尿素酶表型是否陽性之間無必然聯(lián)系。Ⅵ型分泌系統(tǒng)在霍亂弧菌中研究較多,與其致病性有關,2002年,Tagomori等[14]發(fā)現(xiàn)Ⅵ型分泌系統(tǒng)也存在于副溶血性弧菌 RIMD2210633的染色體Ⅰ上,基因編碼為V P1386到V P1420。寧波地區(qū)海產(chǎn)品及環(huán)境副溶血性弧菌分離株中V p1408基因的調(diào)查顯示其檢出率為17.8%,說明Ⅵ型分泌系統(tǒng)在寧波地區(qū)副溶血性弧菌中的分布較廣泛,但其究竟是否貢獻副溶血性弧菌的致病力,本實驗室正在研究。

副溶血性弧菌隨著藥物的廣泛使用,耐藥性越來越嚴重。2007年的寧波地區(qū)副溶血性弧菌分離株對喹諾酮類(諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星)、氯霉素類(氯霉素、氟苯尼考)、四環(huán)素、頭孢噻呋鈉等藥物敏感。對其他種類抗生素均呈不同程度的耐藥,對青霉素類、磺胺類藥物耐藥率極高,超過95%。多重耐藥情況比較嚴重,集中在6耐、7耐和8耐。耐藥譜較窄,以耐磺胺類、青霉素類藥物為主,占所有菌株的94.3%,沒有對所有各類抗菌藥物均耐藥的細菌,也沒有對美國CDC推薦使用各種抗菌藥物(磺胺類、頭孢類、氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物)均耐藥的菌株,但對磺胺類、頭孢類和氨基糖苷類耐藥的有80株,占所有菌株的90.9%,對氟喹諾酮類、氨基苷類、青霉素類、頭孢類、磺胺類等都產(chǎn)生耐藥性的耐藥譜也存在。因此,寧波地區(qū)發(fā)生副溶血性弧菌感染時應盡量避免使用磺胺類藥物、卡那霉素及鏈霉素,可選擇性使用四環(huán)素類藥物、氟喹諾酮類藥物及氨基糖苷類藥物中的阿米卡星或慶大霉素等。

國內(nèi)外對副溶血性弧菌耐藥基因的研究很少,但對霍亂弧菌的耐藥研究較多,鑒于霍亂弧菌和副溶血性弧菌同屬,針對已報道霍亂弧菌對氨基苷類、頭孢類、磺胺類和四環(huán)素類藥物耐藥的耐藥基因,tetB基因能貢獻細菌對四環(huán)素耐藥,bla T EM基因貢獻對青霉素類和頭孢菌素類耐藥,sul2和strB分別耐磺胺甲惡唑和鏈霉素。設計以上耐藥基因引物,分別對88株分離株進行耐藥基因普查。實驗結果顯示,四環(huán)素類耐藥基因tetB的檢測率為0,這與寧波地區(qū)分離菌對四環(huán)素的耐藥表型完全一致;頭孢類耐藥基因bla T EM的攜帶率為91.7%,副溶血性弧菌對第一代頭孢菌素類藥物頭孢唑啉中度耐藥和耐藥的占細菌的95.4%,對頭孢唑啉高度耐藥的均攜帶bla T EM基因,中度耐藥的基本攜帶該基因,說明副溶血性弧菌中還有其他耐藥基因貢獻對頭孢唑啉的耐藥性,也有攜帶基因但對頭孢唑啉敏感的分離菌,結果提示bla T EM對細菌的耐藥性可能存在基因調(diào)控;磺胺類sul2和氨基糖苷類strB的檢測率分別為16.7%和43.3%,結果說明還有其他耐藥基因貢獻對復方新諾明及鏈霉素耐藥,究竟還有哪些耐藥基因貢獻細菌對頭孢菌素類、磺胺類及鏈霉素耐藥,還需要進一步研究。

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