趙麗麗,夏 強(qiáng),2,趙秀芹,劉志廣,萬(wàn)康林

耐藥結(jié)核病尤其耐多藥結(jié)核病(至少對(duì)異煙肼和利福平耐藥)已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。我國(guó)的耐藥結(jié)核病流行情況也較為嚴(yán)重,耐多藥率為8.32%[2],對(duì)于MDR-TB病,目前通常采用二線(xiàn)抗結(jié)核藥物進(jìn)行治療。由于喹諾酮類(lèi)藥物的不良反應(yīng)小,價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),已被 WHO納入耐MDR-TB病的臨床治療方案,成為聯(lián)合治療MDR-TB的核心藥物之一。然而在我國(guó),喹諾酮類(lèi)藥物投入臨床時(shí)間較長(zhǎng)、應(yīng)用的抗菌范圍較廣,致使耐藥形勢(shì)日趨嚴(yán)重,因此,深入MDR-TB對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥情況非常重要。

喹諾酮類(lèi)藥物主要作用于DNA促旋酶,該酶屬于Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶,是由兩個(gè)A亞基(GyrA)和兩個(gè)B亞基(GyrB)組成的四聚體,A亞基由gyrA基因編碼,可以切斷、再結(jié)合和超螺旋化DNA鏈;B亞基由gyrB基因編碼,含ATP水解功能區(qū),能促進(jìn)ATP水解,為A亞基解旋提供能量,DNA促旋酶能在原核細(xì)胞DNA復(fù)制過(guò)程中暫時(shí)切斷DNA雙鏈,引入負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu),使DNA能夠有效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組[3];但喹諾酮類(lèi)藥物能與DNA促旋酶作用形成藥物-DNA-酶復(fù)合物從而抑制DNA促旋酶的活性,阻礙DNA復(fù)制,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。以往的資料表明:gyr基因突變是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的主要原因,其中,這些突變位點(diǎn)主要集中于喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR),即A亞基的第74-113位氨基酸,B亞基的第495-533位氨基酸[4]。本研究通過(guò)DNA直接測(cè)序?qū)?25株MDRTB臨床分離株gyr基因喹諾酮類(lèi)藥物耐藥決定區(qū)的突變情況進(jìn)行分析,探討MDR-TB對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥產(chǎn)生與gyr基因突變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 本試驗(yàn)所涉及的125株MDR-TB臨床分離菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核室提供,其中福建77株(2005年31株,2007年23株,2009年23株),河南14株(2005年),四川19株(2006年),西藏15株(2006年)。參照菌株采用標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv(ATCC 27294),購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 藥敏試驗(yàn)所用氧氟沙星(Ofloxacin)為Sigma產(chǎn)品,使用時(shí)按照廠(chǎng)家提供的純度和效價(jià)計(jì)算用量,氧氟沙星在培養(yǎng)基的終濃度為2μg/mL[5]。藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基的配方、制備,操作步驟和結(jié)果判斷等均參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]。

1.3 DNA制備 采用CTAB法[7],置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 擴(kuò)增gyrA基因耐藥決定區(qū):所用上游引物為:5’-TCGACTATGCGATGA GCGTG-3’,下游引物為 5’CGATGCGTAAACCGACCC-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為860bp,涵蓋編碼gyrA的喹諾酮耐藥決定區(qū)(第74-113位氨基酸)。PCR反應(yīng)體系總體積為 20μL,其中,2 ×Taq PCR MasterMix 10μL(TIANGEN),DNA 模板 1μL(50 ng),Forward Primer(20 mmol/L)1μL,Reverse Primer(20 mmol/L)1μL,無(wú)菌雙蒸水7μL;陰性對(duì)照反應(yīng)體系中不加DNA模板,無(wú)菌雙蒸水8μL,其他不變。反應(yīng)條件:95℃5 min;95℃30 s,58.5℃30 s,72℃40 s,30次循環(huán);72℃3min。

1.4.2 擴(kuò)增gyrB基因耐藥決定區(qū) 所用上游引物為 5’-CCGCTGTGATCTCGGTGAAG-3’,下游引物為5’AGACCCTTGTACCGCTGAATG-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為780bp,涵蓋編碼gyrB的喹諾酮耐藥決定區(qū)(第495-533位氨基酸),PCR反應(yīng)體系總體積為 20μL,其中 ,2 ×Taq PCR MasterMix 10μL(TIAN GEN),DNA 模板 1μL(50 ng),Forward Primer(20 mmol/L)1μL,Reverse Primer(20 mM)1μL,無(wú)菌雙蒸水 7μL;陰性對(duì)照反應(yīng)體系中不加DNA模板,無(wú)菌雙蒸水8μL,其他不變。反應(yīng)條件:95℃5 min;95℃30 s,57℃30 s,72℃40 s,30次循環(huán);72℃3min。

1.5 序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 分析方法 使用MegAlign軟件對(duì)基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果判斷參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》,根據(jù)耐藥百分比判別[6]:耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù))×100%,若耐藥百分比>1%為耐藥(R),≤1%為敏感(S)。經(jīng)藥敏試驗(yàn)鑒定,125株MDR-TB中有50株對(duì)喹諾酮藥物耐藥,其余75株為敏感,質(zhì)控菌株H37Rv藥敏結(jié)果為敏感。

2.2gyrA和gyrBPCR檢測(cè) 將125株MDRTB及H37Rv的gyrA和gyrB的QRDR分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果均為陽(yáng)性,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為860bp 和 780bp,如圖 1,圖 2。

圖1 PCR得到 gyrA的QRDRsM:DNA標(biāo)準(zhǔn);1-6:菌株編號(hào);7:陰性對(duì)照;8:H37RvFig.1 PCR product ofgyrAQRDRsM:DNA marker;1-6:the clinical isolates;7:negative control;8:H37Rv

2.3 基因測(cè)序分析

圖2 PCR得到 gyrB的 QRDR1-6:菌株編號(hào);7:陰性對(duì)照;8:H37Rv;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 PCR product ofgyrBQRDR1-6:the clinical isolates;7:negative control;8:H37Rv;M:DNA marker

表1 耐喹諾酮MDR-TB臨床分離株 gyrA基因突變特點(diǎn)Table 1 The characteristics ofgyrAgene mutations of quinolone resistant MDR-TB clinical isolates

2.3.1gyrA基因突變分析 H37Rv的gyrA基因未見(jiàn)突變。125株MDR-TB臨床分離株的第95位點(diǎn)均由AGC→ACC。75株喹諾酮敏感菌株未見(jiàn)其他位點(diǎn)突變,50株喹諾酮耐藥菌株有39株發(fā)生其他位點(diǎn)的突變:主要分布在90,91和94位點(diǎn),其中有兩株發(fā)生雙位點(diǎn)突變,具體突變類(lèi)型及突變率(突變的耐藥菌株數(shù)/耐藥菌株數(shù))見(jiàn)表1。

2.3.2gyrB基因突變分析 H37Rv的gyrB基因未見(jiàn)突變,125株MDR-TB臨床分離株中有5株發(fā)生突變,突變菌株均為喹諾酮耐藥菌株,其中,4株伴隨gyrA突變,具體突變類(lèi)型及突變情況見(jiàn)表2。

表2 耐喹諾酮MDR-TB臨床分離株 gyrb基因突變特點(diǎn)Table 2 The characteristics ofgyrBgene mutations of quinolone resistant MDR-TB clinical isolates

3 討 論

喹諾酮類(lèi)藥物作為一類(lèi)重要的抗結(jié)核藥物,已被廣泛用于MDR-TB的治療,但我們的研究發(fā)現(xiàn):125株MDR-TB中有50株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥,耐藥率高達(dá)40%,提示MDR-TB中,喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥情況比較嚴(yán)重,這可能與臨床上長(zhǎng)期、廣泛和不規(guī)則地使用喹諾酮類(lèi)藥物有關(guān)。因此,建議在MDR-TB的治療中,不能盲目使用喹諾酮類(lèi)藥物,應(yīng)先進(jìn)行該類(lèi)藥物的藥敏檢測(cè)并結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)用藥。

MTB對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥通常與gyr基因突變、藥物外排泵或細(xì)胞壁的通透性有關(guān),其中以gyr基因突變?yōu)橹鱗8]。我們的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn):在50株氯氟沙酮的 MDR-TB中,有40株gyr基因發(fā)生突變,其中39株gyrA基因發(fā)生突變,突變率為78%(39/50),與以往的文獻(xiàn)報(bào)道接近[9-10],5株gyrB基因發(fā)生突變,但有4株伴隨gyrA基因突變。

gyrA基因突變株中,以94位點(diǎn)較為常見(jiàn),占gyrA基因突變的61.5%(24/39),其中有2株合并90或91位點(diǎn)的突變。gyrB基因突變主要位于500,506,534和539位點(diǎn),但絕大多數(shù)都伴隨gyrA基因突變。

此外,125株MDR-TB的gyrA基因95位點(diǎn)均由AGC突變?yōu)锳CC,也進(jìn)一步支持 SHI等[11-12]的觀(guān)點(diǎn):gyrA基因95位點(diǎn)突變與基因的遺傳多態(tài)性有關(guān),而與對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥關(guān)系不大。

由此可見(jiàn),MDR-TB對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥主要與gyr基因突變有關(guān),其中g(shù)yrA基因突變是gyr基因突變的主要形式,且特異性較高,可以考慮通過(guò)檢測(cè)gyrA基因快速預(yù)測(cè)菌株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥表型;gyrB基因也會(huì)發(fā)生突變,但絕大多數(shù)都伴隨gyrA基因突變,很少發(fā)生單獨(dú)gyrB基因基因突變的情況。

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