邢在臣 曹秀真 張古泉 曾國慶

(1.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東，泰安 271000； 2.泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院，山東，泰安 271000)

臨床上，牙齒因外傷脫落首選治療方法是進行牙再植，植入后成功的關鍵是牙周膜再附著。對于干燥時間超過1小時的脫落牙齒，大部分牙周膜細胞已經(jīng)壞死，僅有20%左右存活[1]，不經(jīng)處理植入，大部分再植牙短期內(nèi)會出現(xiàn)根吸收，最終脫落，因此，促進延遲再植牙殘存的有活性的牙周膜細胞更有效地在根面上附著、增殖和分化是防止根吸收的重要措施，也是牙再植研究的重點。單獨應用釉基質(zhì)蛋白或四環(huán)素對再植牙的影響，國內(nèi)外已經(jīng)有研究。本實驗試圖通過釉基質(zhì)蛋白聯(lián)合四環(huán)素對延遲再植牙的牙根進行處理，從組織學觀察其對延遲再植牙牙周再生的影響，為臨床尋找一條能促進再植牙牙周纖維再附著、減少牙根吸收的有效方法。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物 健康成年雜種犬3條，雌雄不限，10～12月齡，體重9-10公斤 。選上頜雙側(cè)第1、 2牙和下頜雙側(cè)第2、 3牙為受試牙,共24 顆,隨機分為實驗組A、B和對照組,每組8 顆。

1．1．2實驗材料

釉基質(zhì)蛋白(EMDOGAIN)： 瑞典Biora公司鹽酸四環(huán)素( 粉劑) 美國sigma, 用雙蒸水將其配制成20g/L的溶液

1．1．3實驗儀器

生物光學顯微鏡： 日本 Olympus公司生產(chǎn)根管治療器械、拔牙手術器械與高速渦輪牙鉆機、奧林派司光學顯微鏡 、組織切片機 、圖文掃描儀、高清晰度彩色病理圖文計算機分析系統(tǒng)

1．2方法

1.2.1根管處理

麻醉:以3%戊巴比妥鈉按45mg/kg體重行腹腔麻醉； 根管充填:按常規(guī)方法處理,用牙膠尖與碘仿糊劑作根充,磷酸鋅粘固粉墊底,玻璃離子封閉；治療結(jié)束時肌注林可霉素0.6g，術后7d每日肌注林可霉素0.6g，分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)軟食。

1.2.2拔牙和再植

拔牙及干燥: 根管充填后一周,腹腔麻醉,取模，常規(guī)消毒,先用牙挺挺松受試牙,繼續(xù)用牙鉗握持牙冠旋轉(zhuǎn)使之脫位；術中盡量減少對牙槽窩和牙根表面的損傷，將脫位牙擱置在經(jīng)高溫高壓消毒的干燥木板上自然干燥1h；30min時,將牙翻身干燥另一面。

牙處理: 實驗組A 8顆牙齒置于20g/L 的鹽酸四環(huán)素溶液中浸泡5min，風槍吹干，牙根表面涂抹EMDOGAIN。 實驗組B 8顆牙直接牙根表面涂抹EMDOGAIN。對照組不經(jīng)過TET和EMDOGAIN處理。

牙槽窩處理：生理鹽水沖洗牙槽窩以便去掉血塊和碎屑，再植前兩實驗組牙槽窩均涂抹釉基質(zhì)蛋白，對照組僅用生理鹽水沖洗。

再植：將受試牙植入原牙槽窩中,印模對照，確保完全復位，用3-0可吸收縫線攏縫合近、遠中牙齦做固定。術畢連續(xù)3d,每天給予林可霉素0.6g肌注一次。

飼養(yǎng):分籠軟食喂養(yǎng)。生理鹽水清洗口腔 每日3次連續(xù)7天

取材：12周后,經(jīng)腹腔內(nèi)注射過量3%戊巴比妥鈉,采用股動脈放血法處死實驗犬。首先肉眼觀察再植牙存留數(shù)量、牙齦愈合情況,接著取出前份上、下頜骨,按照實驗牙位分別截成骨塊。

1.2.3切片制作 將骨塊置于10%甲醛中固定，5%甲酸脫鈣，石蠟包埋，沿與牙體長軸垂直間隔500 μm片厚5 μm，伊紅-蘇木素染色。

1.2.4組織學觀察 參考Andreasen 的方法[2],將牙根愈合的狀況分為3 種類型: ①牙周膜性愈合:即牙骨質(zhì)完整,周圍組織無炎癥,包括牙周膜愈合以及牙骨質(zhì)無缺損而牙周膜被增生牙槽骨替代的兩種情況； ②牙根炎癥性吸收； ③牙根替代性吸收。對每顆牙的牙根觀察9張切片。在蓋玻片上劃"米"字形的八等分線條,將此蓋玻片覆蓋在已作封閉處理的組織切片上。光鏡下調(diào)整蓋玻片,使其上兩條互相垂直的線條分別通過牙根橫斷面的唇舌向軸與近遠中向軸,且"米"字形的中心位于根管的中心。由此獲得八等分線條與根面的8 個交點,此即每張切片的觀察記錄點。按照每觀察點所屬愈合類型，分類計數(shù)。先計算出每顆牙每一種牙根愈合類型的百分比, 即表明某一牙根愈合類型的觀察點的總數(shù)除以每顆牙觀察點的總數(shù)再乘100%。再計算各實驗組與對照組每一種牙根愈合類型的百分比均數(shù)。

1.2.5統(tǒng)計學分析 采用樣本均數(shù)差別的t檢驗的方法,各組間進行有關組織學類型的百分比均值的兩兩比較與分析

2 結(jié) 果

臨床檢查：所選擇的24顆牙齒，無松動, 牙齦無充血、水腫或退縮

組織學觀察：本實驗觀察牙根三種類型，牙周膜愈合：牙骨質(zhì)完整無缺損, 包括愈合過程中始終無牙骨質(zhì)吸收或先有吸收后得到修復的情況，牙周膜愈合是再植牙的理想愈合方式(圖1)。炎性吸收：牙骨質(zhì)及牙本質(zhì)被吸收，炎性結(jié)締組織侵入吸收區(qū)，吸收區(qū)內(nèi)可見淋巴細胞、多核巨細胞等炎細胞浸潤(圖2)。 替代性吸收：牙周膜喪失牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)被吸收, 吸收區(qū)內(nèi)可見新牙槽骨形成(圖3)。

圖1 牙骨質(zhì)無缺損, 牙周膜被增生牙槽骨替代(HE40)

圖2 牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)被吸收,炎性結(jié)締組織侵入吸收區(qū)(HE40)

圖3 牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)被吸收, 吸收區(qū)可見新生牙槽骨(HE40)

由表1可見:(一)實驗組A牙周膜愈合的百分比均值高于實驗組B和對照組者,與對照組比較有高度顯著性差異(P<0.01)，實驗組A、B比較差異有顯著性(P>0.05)。(二)實驗組A牙根炎癥性吸收的百分比均值低于實驗組B和對照組者,有高度顯著性差異(P<0.01)，實驗組B和對照組差異無顯著性(P>0.05)(三)各組間替代性吸收的百分比均值兩兩比較差異無顯著性(P>0.05) 。

組別實驗數(shù)牙周膜性愈合炎性吸收替代吸收實驗組AEMDOGAIN+TEP828.92±7.605.52±3.8965.57±21.42實驗組BEMDOGAIN820.75±6.6912.37±6.9466.89±19.81對照組812.36±5.1315.41±6.1772.24±18.02

3. 討 論

關于試驗牙齒的選擇和根管治療時機，實驗選擇上頜1、2牙以及下頜雙側(cè)第2、3牙為受試牙,因為這些牙均為單根牙,便于牙齒拔除，減少對牙槽窩的損傷，再者根管處理相對簡單,試驗前一周對受試牙根管治療，排除再植后牙髓壞死感染引起牙根炎癥性吸收，避免拔牙后進行根管處理時所造成的根面牙周膜的機械損傷，并且受試牙的離體和干燥時間更容易控制也更準確[3]。牙周膜愈合是再植牙的理想愈合方式，牙骨質(zhì)愈合是指牙骨質(zhì)完整無缺損,包括愈合過程中始終無牙骨質(zhì)吸收或先有吸收后得到修復的情況。牙當干燥時間超過60 min時，根面存活的PDL (periodontal ligament, 牙周膜)細胞數(shù)量顯著減少，再植后較少存在牙周膜愈合,牙周膜骨替代可以被認為是延期再植干燥牙經(jīng)藥物處理后愈合改善的一種組織學表現(xiàn)形式，本實驗將兩者都歸類為牙周膜愈合。

釉質(zhì)基質(zhì)蛋白是在牙胚發(fā)育過程中由赫特威上皮根鞘分泌而成, 是一種特別的多功能生長因子, 它提供了一個特殊的細胞-基質(zhì)相互作用的微環(huán)境[4]，影響細胞的多種生物學功能[5]，是一種能選擇性促進牙周膜細胞再生的蛋白質(zhì), EMPs的主要成分是釉原蛋白, 在中性pH值和體溫下是疏水的,應用后在根面區(qū)域能形成蛋白質(zhì)聚集物,調(diào)節(jié)細胞-基質(zhì)間的相互作用,通過促進細胞的增殖和分化, 從而促進受損牙周組織的再生[6]。EMPs通過促進PDL細胞增殖、提高PDL細胞分泌蛋白的總量、促進PDL細胞形成礦結(jié)節(jié)，PDL細胞在EMPs作用下的這三種變化直接有助于其對受損PDL的修復和再生。EMPs能優(yōu)先刺激受損牙根面有活性的PDL細胞增殖、抑制上皮細胞增殖，當根周炎性反應消退后，這些增殖的PDL細飽以數(shù)量優(yōu)勢覆蓋了根面，并進而形成無細胞性牙骨質(zhì)、牙周韌帶和牙槽骨，從而導致了牙周組織再生。本實驗結(jié)果同樣顯示，應用EMPS的兩實驗組的牙周膜愈合百分數(shù)均值遠高于對照組，差異有明顯顯著性。

四環(huán)素由于具有抗菌以及抑制破骨細胞與金屬蛋白酶活性的作用,已被用于牙周病治療的研究和再植牙的處理[7]。實驗結(jié)果顯示，采用EMPS和四環(huán)素聯(lián)合應用的實驗組A，牙根炎癥性吸收百分比均數(shù)顯著低于單純使用EMPS實驗組B和對照組。四環(huán)素溶液浸泡降低牙根炎癥性吸收的機理在于, 四環(huán)素具有抗金屬蛋白酶和破骨細胞活性的作用,致使牙根硬組織遭炎癥吸收的過程可以被縮短或終止; 此外, 相對于全身應用而言, 四環(huán)素局部應用具有殺菌而非抑菌作用, 可以更加有效地控制細菌的繁殖, 從而削弱干燥牙再植后炎癥反應的程度并縮短其持續(xù)時間。鹽酸四環(huán)素還可使根面輕度脫礦, 膠原纖維暴露, 改變了根面的狀態(tài), 使根面的生物相容性提高, 使生長因子易于與其親和，更有利于EMPs在牙周再生中發(fā)揮其最大的生物學效應,這種情況下使用生物因子EMPs, 能充分發(fā)揮EMPs對PDL細胞的調(diào)節(jié)作用，如果牙根根面有玷污層存在，則抑制生長因子的生物活性[8][9]。實驗組A EMPs和四環(huán)素聯(lián)合應用，其牙周膜愈合百分比高于單純使用EMPs的實驗組B，兩者有高度顯著性差異(P<0.01)，表明四環(huán)素與EMPS具有很好的協(xié)同作用，能很好的促進牙周膜的愈合。替代性吸收在兩實驗組和對照組間有差異，但沒有統(tǒng)計學意義，分析原因，首先是因為局部應用四環(huán)素可通過抗菌作用在一定程度上減輕干燥牙再植后的炎癥反應,但并不能完全制止非感染因素引起炎癥反應，再者隨著時間的延長，EMPS逐漸被降解，促進牙周膜的作用也逐漸消失。

綜上所述，四環(huán)素和EMPS局部聯(lián)合應用，應用能減少干燥再植牙炎性吸收、促進牙周愈合，有一定的臨床價值，但有待進一步深入研究。

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