徐巖，蔡軍(濟南市口腔醫(yī)院，濟南250014)

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保留根面牙骨質(zhì)對人牙周韌帶細胞分化的影響

徐巖，蔡軍
(濟南市口腔醫(yī)院，濟南250014)

目的 觀察保留健康牙骨質(zhì)對人牙周韌帶細胞分化的影響。方法 取正畸患者拔除的健康前磨牙，從牙根的近中和遠中面釉牙骨質(zhì)界下2 mm制備對稱的5 mm×4 mm的牙片43對，隨機分成觀察組(保留牙骨質(zhì))和對照組(去除牙骨質(zhì))各43張。刮取牙周膜組織，按組織塊貼壁法培養(yǎng)牙周韌帶細胞，分離培養(yǎng)后，取兩組各23張牙片，將細胞接種到牙片上共培養(yǎng)，制成PDLC-牙片復(fù)合體。7 d后刮除并收集PDLC-牙片復(fù)合體上的細胞，采用RT-PCR方法檢測成牙骨質(zhì)標記物牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)和牙骨質(zhì)蛋白23(CP-23)表達。取兩組剩余的20張牙片制成細胞-牙片復(fù)合體放入半透明膜中，植入裸鼠體內(nèi)，8周后比較兩組牙片表面新形成的硬組織情況，并采用免疫組化方法觀察骨橋蛋白(OPN)和骨唾液蛋白(BSP)表達。結(jié)果 觀察組CAP和CP-23表達較對照組升高(P均<0.01)。植入裸鼠體內(nèi)，8周后觀察組14張牙片顯示原有牙骨質(zhì)上有牙骨質(zhì)樣基質(zhì)形成；新舊牙骨質(zhì)間并未觀察到裂隙。對照組17張牙片在牙根表面有纖維組織形成，并且新纖維組織和牙本質(zhì)表面間均可觀察到不同寬度的裂隙。新形成的牙骨質(zhì)樣基質(zhì)中，骨橋蛋白和骨唾液蛋白均呈陽性。結(jié)論 保留健康牙根表面的牙骨質(zhì)可能促進人牙周韌帶細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化，有利于牙周組織愈合。

牙骨質(zhì)；牙周組織；細胞分化；牙周韌帶細胞；牙骨質(zhì)細胞；牙骨質(zhì)附著蛋白；牙骨質(zhì)蛋白23；骨橋蛋白；骨唾液蛋白

牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的獨特礦化組織，是一薄層結(jié)締組織覆蓋根面，其主要作用是鉚釘牙周膜纖維，對于牙齒以及牙周組織的穩(wěn)定有著重要的作用[1]。以往的牙周組織再生實驗以及臨床牙周治療中，一般建議將牙骨質(zhì)完全去除，目的是將病變牙骨質(zhì)完全去除。在牙周炎的過程中，牙骨質(zhì)會在結(jié)構(gòu)和生化形狀上發(fā)生變化[2]。牙骨質(zhì)中含有一些與牙骨質(zhì)形成、牙周韌帶附著及牙周韌帶細胞(PDLC)胞外基質(zhì)的合成等有關(guān)的非膠原蛋白質(zhì)。研究顯示，牙骨質(zhì)至少含有兩種特異性蛋白，即牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)[3]和牙骨質(zhì)源性生長因子(CGF)[4]，它們是存在于牙骨質(zhì)基質(zhì)中并能促進牙周膜細胞黏附、增殖、趨化、移行以及成牙骨質(zhì)細胞分化等功能的活性物質(zhì)。牙骨質(zhì)蛋白23(CP-23)是鑒別牙骨質(zhì)樣細胞的標記物[5]，能夠在人成牙骨質(zhì)細胞來源細胞系的培養(yǎng)基中識別出來。而PDLC不是單一細胞類型，其具有多向分化潛能，在適當?shù)沫h(huán)境條件和刺激因素作用下，可以向成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞方向分化，形成牙骨質(zhì)和牙槽骨[6]。2006年3月～2007年12月，我們將PDLC細胞與牙片共培養(yǎng)后，檢測細胞中CAP、CP-23 mRNA的表達，并將保留牙骨質(zhì)的牙片與不保留牙骨質(zhì)的牙片制成PDLC-牙片復(fù)合體植入裸鼠體內(nèi)，8周后觀察牙片表面硬組織形成情況，牙片中骨唾液蛋白(BSP)和骨橋蛋白(OPN)表達情況，探討健康牙根表面的牙骨質(zhì)能否促進人PDLC向成牙骨質(zhì)細胞分化，探索根面保留牙骨質(zhì)對牙周組織再生的影響，為牙骨質(zhì)的發(fā)育機制以及影響牙周組織再生的因素提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集25例正畸患者拔除的43顆前磨牙，患者年齡12～20歲。4周齡健康裸鼠20只，雌雄不限，購于北京大學醫(yī)學部動物中心，體質(zhì)量18～24 g。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，USA)；青霉素、鏈霉素(以下簡稱雙抗，華北制藥股份有限公司)；EDTA(華美生物工程公司)；TRIzol(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，USA)；PCR擴增試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；兔抗人骨橋蛋白(LF-123)、兔抗人骨唾液蛋白(LF-100)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(北京金橋國際公司)；實時RT-PCR儀；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus)。

1.2 PDLC的培養(yǎng) 刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，按組織塊貼壁法，加入含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞長滿瓶底的70%～80%，按1∶2傳代。收集第二代PDLC制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×106/mL。

1.3 牙片的制備 取43顆前磨牙，刮除根近中和遠中面的牙周韌帶，將牙根縱劈為兩半，去除牙髓組織。一半徹底刮除根面牙骨質(zhì)，暴露牙本質(zhì)，作為對照組；另一半則保留牙骨質(zhì)，不暴露其下的牙本質(zhì)，作為觀察組。用細金剛砂車針從牙根鄰面釉牙骨質(zhì)界下2 mm制備對稱的5 mm×4 mm的牙片43對。

1.4 PDLC-牙片復(fù)合體的制備 將兩組牙片放置在培養(yǎng)皿中，表面用EDTA凝膠處理3 min，暴露膠原。取牙片置于48孔板內(nèi)，加入制備好的PDLC懸液，37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育2.5 h。加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培育7 d。待細胞長滿孔板底部，取出PDLC-牙片復(fù)合體，用于以下實驗。

1.5 PDLC中CAP、CP23 mRNA表達檢測 采用RT-PCR方法。取兩組各23個PDLC-牙片復(fù)合體，收集牙片上的細胞。使用TRIzol試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。以?actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計并合成引物。CAP引物序列：上游5′-CCTGGCTCACCTTCTACGAC-3′，下游5′-CCTCAAGCAAGGCAAATGTC-3′；CP-23引物序列：上游5′-GGCGATGCTCAACCTCTAAC-3′，下游5′-CCTCAAGCAAGGCAAATTC-3′；β-actin引物序列：上游5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′，下游5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。擴增條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，59 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)45次。標準曲線使用LightCycler 4.0軟件分析，以目的基因與β-actin的灰度比值表示目的基因的相對表達量。

1.6 PDLC-牙片復(fù)合體的活體植入 取兩組剩余的20個PDLC-牙片復(fù)合體，放入已消毒的聚四氟乙烯微孔薄膜呈袋狀包被，防止移植后裸鼠細胞浸潤根片。將裸鼠用氯胺酮5 mg/kg腹膜下注射麻醉，于背部兩側(cè)分別作2個縱切口，分離、暴露皮下組織。將已包被的PDLC-牙片復(fù)合體植入裸鼠皮下，一側(cè)為牙骨質(zhì)片，另一側(cè)為牙本質(zhì)片，縫合傷口。飼養(yǎng)8周后以斷頸法處死裸鼠，將牙片取出。

1.7 牙片表面新生組織觀察 將牙片用多聚甲醛溶液4 ℃下固定24 h，加入140 g/L EDTA脫鈣液脫鈣，取出牙片沖洗，脫水，石蠟包埋。與牙長軸平行，近遠中向制作5 μm連續(xù)切片，取經(jīng)過中間部分的切片，行HE染色，倒置相差顯微鏡下觀察牙片表面是否有新生成的組織。

1.8 牙片中BSP、OPN表達檢測 采用免疫組化方法。將切取的牙片加入一抗(兔抗人OPN、兔抗人BSP)，1∶100稀釋，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體作為二抗，DAB顯色。鏡下觀察牙片中有棕色染色為BSP、OPN陽性。

2 結(jié)果

2.1 兩組PDLC中CAP、CP-23 mRNA表達比較 與PDLC細胞共培養(yǎng)7 d后，觀察組PDLC中CAP、CP-23 mRNA的相對表達量分別為0.004 35±0.000 34、0.000 07±0.000 02，對照組分別為0.002 91±0.000 21、0.000 000 66±0.000 000 04，觀察組CAP、CP-23 mRNA表達均高于對照組(P均<0.01)。

2.2 兩組牙片新組織形成情況 觀察組中，有14個牙片在原有的牙骨質(zhì)表面有一層新形成的牙骨質(zhì)樣基質(zhì)(NFC)，而且NFC的密度比較低，部分有細胞嵌入。在NFC和聚四氟乙烯微孔薄膜之間有疏松的纖維樣組織，空隙較大。而對照組無新的牙骨質(zhì)形成，有新生成的纖維樣組織形成，與根面之間有很大的間隙，并且越靠近根面密度越大。

2.3 觀察組牙片中BSP、OPN表達情況 BSP在NFC中呈弱陽性，越靠近根面染色越強；在原有的牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)中染色不明顯。OPN在NFC中呈陽性，越靠近原有的牙骨質(zhì)陽性越強，在原有牙骨質(zhì)呈中等陽性，在牙本質(zhì)中沒有著色。

3 討論

牙骨質(zhì)除了能夠提供牙周組織的附著，也可以保護牙本質(zhì)，阻止牙本質(zhì)在病理條件下吸收。即使暴露在牙周袋中，牙骨質(zhì)也不是很容易發(fā)生吸收[7]。在體內(nèi)暴露牙本質(zhì)可以引起破骨細胞在牙根基面啟動吸收過程，這可能喚起趨化因子和激活信號的激活[8]?；谶@一點，牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)在調(diào)節(jié)和招募PDLC方面有很大不同。本研究結(jié)果顯示，在體外牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)表面出現(xiàn)了PDLC的黏附和生成。

成牙骨質(zhì)細胞能夠生成牙骨質(zhì)，但是它們同成骨細胞相似，很難區(qū)分。CAP是一種膠原樣蛋白，可作為成人PDLC中特定的成牙骨質(zhì)細胞祖細胞的標記物[9]。CP-23是鑒別牙骨質(zhì)樣細胞的標記物[5]，能夠在人成牙骨質(zhì)細胞來源細胞系的培養(yǎng)基中識別出來。本研究顯示，接種于牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)表面的PDLC中均有CAP、CP-23 mRNA表達，與對照組比較，觀察組CP-23 mRNA表達升高，表明先前存在的牙骨質(zhì)可能促進PDLC向成牙骨質(zhì)細胞分化。

我們將PDLC-牙片復(fù)合體接種到裸鼠皮下，飼養(yǎng)8周后發(fā)現(xiàn)，NFC直接形成在原有的牙骨質(zhì)表面，其密度和結(jié)構(gòu)較原有的牙骨質(zhì)疏松，部分牙片中可見少量細胞嵌入基質(zhì)內(nèi)。免疫組化染色顯示，NFC中BSP、OPN均呈陽性。BSP、OPN參與組織礦化，在成牙骨質(zhì)細胞祖細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化過程中扮演重要角色[11]。其表達與新的牙骨質(zhì)附著有關(guān)[12]。表明PDLC細胞在原有牙骨質(zhì)存在的情況下，能夠促進其向成牙骨質(zhì)細胞方向分化。除了在原有的牙骨質(zhì)表面形成NFC，PLDC還可以形成纖維樣組織，且牙骨質(zhì)上的纖維樣組織少于牙本質(zhì)。表明移植到牙骨質(zhì)上的細胞能夠形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和纖維樣結(jié)構(gòu)，而移植到牙本質(zhì)上的細胞形成了更多的纖維樣組織。這可能解釋了PLDC的異質(zhì)性。

牙周韌帶中包含各種類型的細胞，包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞和間充質(zhì)干細胞。因此，體外培養(yǎng)PDLC可能會形成多樣性的細胞群，而且PDLC中有一定數(shù)量的干細胞存在[13]。本研究結(jié)果顯示，當PDLC接種到牙片上時，牙骨質(zhì)的存留更適合PDLC中干細胞或成牙骨質(zhì)細胞的祖細胞分化為成牙骨質(zhì)細胞，同時在PDLC中的成纖維細胞形成薄的纖維組織。然而牙本質(zhì)表面更適合于成纖維細胞的生長，形成更多的纖維組織。

在臨床治療牙周炎時，為了將病變牙骨質(zhì)徹底清除，一般建議將牙骨質(zhì)完全去除。本研究結(jié)果顯示，保留牙根表面部分的牙骨質(zhì)可以促進人牙周韌帶細胞向成牙骨質(zhì)細胞分化，形成NFC，有利于牙骨質(zhì)的修復(fù)以及牙周組織的愈合；完全去除牙骨質(zhì)反而不利于牙周組織的再生和愈合。因此建議，在臨床治療中，宜用溫和的力量去除病變牙骨質(zhì)的表面層，只去除牙根表面感染的牙骨質(zhì)而保留大部分牙骨質(zhì)，更有利于患者的預(yù)后。

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山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金(BS2013YY056)。

蔡軍(E-mail: caijun168168@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.012

R78

A

1002-266X(2017)26-0041-03

2017-03-01)