袁 夢，車念聰，趙 暉，夏 蓉，季巍巍，法振鵬

(首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD)是一種肝組織學改變與酒精性肝病(ALD)相類似但無過量飲酒史的臨床病理綜合征，由遺傳-環(huán)境-代謝應激相關因素所致。其發(fā)病機制尚不明確，較為流行的是Day et al[1]提出的“二次打擊”學說，初次打擊主要為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)促使肝臟甘油三酯(triglyeride，TG)蓄積，導致肝細胞對內外源性損害因子的敏感性增強。而炎癥因子產生，游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)增多，肝細胞內 TG氧化增多，肝細胞能量儲備不足，內毒素、鐵蓄積等因素則通過誘發(fā)氧化應激導致脂質過氧化損傷，對肝臟進行第二次打擊。除非能及時阻止炎癥壞死循環(huán)，否則將進展為肝纖維化和肝硬化[2、3]。NAFLD在中醫(yī)學中多以痰瘀互結作為基本病機[4]，痰和瘀是其發(fā)病的關鍵要素。根據這一理論，本課題組選用化痰基礎方二陳湯及活血基礎方桃紅四物湯對NAFLD模型大鼠進行治療。前期的研究表明，上述兩方在不同階段對IR抵抗有一定程度的改善作用[5]，而其具體作用機制尚不明確。為進一步探討NAFLD發(fā)病機理，以及二陳湯和桃紅四物湯的作用靶點，本實驗定性及定量地對肝組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)及白介素-6(interleukin6，IL-6)的表達進行觀察和測定，為臨床防治NAFLD提供客觀依據。

1 材料及方法

1.1 材料

SD大鼠72只，SPF級，初始體質量180g±10g，北京維通利華實驗動物科學技術有限公司;高脂飼料配方:10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉+普通飼料至100g:北京科澳協力飼料加工有限公司;中藥飲片為北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司;羅格列酮為葛蘭素史克公司產品;二甲雙胍為中美上海施貴寶公司;四氯化碳溶液為北京化學試劑公司;兔抗TNF-α、IL-6抗體為北京博奧森生物技術有限公司;兔超敏二步法免疫組化檢測試劑為北京中杉金橋生物技術有限公司;大鼠TNF-a、IL-6酶聯免疫檢測試劑盒，ENDOGEN(美國)公司;紫外分光光度計:UV-1700，日本島津;低溫離心機:Biofuge15R，Heraeus sepatech德國;電子分析天平:JA-1003，上海精科天平廠;電動玻璃勻漿機:DY89-1，寧波新芝生物科技股份有限公司;恒溫水浴鍋為天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;渦旋混勻器:WH-861，北京科爾德科貿有限公司;Labofuge 400R低溫離心機為德國 Heraeus;酶標儀:Multiskan MK3型，芬蘭 Thermo BioAnalysis Company。

1.2 方劑制備及給藥量

二陳湯和桃紅四物湯劑量參考上?？茖W技術出版社1998年第6版《方劑學》。二陳湯:橘紅15 g，半夏15 g，茯苓9 g，甘草5 g;桃紅四物湯:川芎6 g，赤芍 6g，當歸 9g，紅花 9g，熟地 9g，桃仁 12g。各方按處方比例購置藥材，傳統方法煎煮中藥。蒸餾水溶解羅格列酮片劑及二甲雙胍片劑，制備羅格列酮0.30mg/ml、二甲雙胍30mg/ml溶液。西藥對照組按羅格列酮1.5mg/kg·d聯合二甲雙胍150mg/kg·d的給藥量，治療組按二陳湯7.5g/(kg·d)、桃紅四物湯8.5g/(kg·d)的量給動物灌服(相當于人體正常用量的10倍)，正常組和模型組以1ml/100g體重的標準灌服蒸餾水，每天1次至實驗結束。

1.3 動物模型復制

同批次健康成年雄性SD大鼠72只，SPF級，初始體重180g±10g，適應性喂養(yǎng)5d后，按體重區(qū)組分層隨機分為空白對照組12只，模型組、西藥對照組、二陳湯組、桃紅四物湯組各15只。參考文獻[6]進行模型復制:模型組和3個藥物組以高脂飼料飼養(yǎng)，從第5周起按0.2 mL/100g體重的標準給予40%四氯化碳豆油溶液，從大鼠背部后側皮下注射每周2次，共3周。空白對照組始終喂以普通飼料。飼養(yǎng)期間，模型組死亡2只大鼠。從造模開始，二陳湯組和桃紅四物湯組即分別灌服二陳湯、桃紅四物湯，西藥對照組灌服羅格列酮與二甲雙胍混合溶液，模型組和空白對照組灌服蒸餾水。

1.4 動物采樣及樣本處理

第8周末動物飼養(yǎng)結束，大鼠斷頭采血處死，迅速取出肝臟，觀察肝臟顏色質地特征，取1cm×3cm肝組織以10%甲醛固定，脫水、石蠟包埋固定、切片、HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學改變，剩余肝組織－80℃凍存。

1.5 病理切片處理

1.5.1 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、復水，TNF-α采用微波修復法，IL-6采用胰酶修復法進行抗原修復，3%過氧化氫溶液浸染切片10min阻斷生物酶，PBS緩沖液清洗后入一抗(1∶100稀釋)，4℃冰箱過夜。取出后室溫復溫后加入聚合物輔助劑(試劑1)37℃孵育30min，PBS沖洗，入辣根酶標記抗兔IgG多聚體 37℃孵育60min，1∶20 DAB顯色劑顯色5min，蘇木素復染細胞核，常規(guī)脫水固定，中性樹膠封片。

1.5.2 圖像處理 TNF-α及IL-6陽性細胞均為胞漿或胞核呈棕黃色或深棕黃色顆粒，在NIKON Eclipse 80i生物顯微鏡下以高倍鏡(×40)觀察，選取染色均勻的3-5個視野的陽性表達細胞，應用NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統統計每個視野下陽性顆粒的表達面積(Area)和積分光密度(SumDensity)，以反映 TNF-α和 IL-6在肝組織中的分布強度。

1.6 酶聯反應法測定TNF-α、IL-6含量

肝組織稱重后在冰浴(4℃)中制成10%的組織勻漿，4000r/min離心10min取上清，生理鹽水稀釋成5%的組織勻漿用于檢測，嚴格按照說明書建立標準曲線進行樣本測定和結果計算。

1.7 統計方法

數據利用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析，并進行LSD組間比較，計量資料用均數±標準差表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織病理改變的影響

圖1～5顯示，40倍光鏡下觀察肝組織HE染色切片，正常組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞無變性、壞死，可及肝竇充血。模型組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞呈脂肪變性顯著，視野滿布中到小泡性脂肪變性，可及大泡脂肪空泡，呈局灶分布伴空泡融合，病變以中央靜脈周圍嚴重，脂肪變性肝細胞腫脹，胞核被脂肪空泡推擠發(fā)生偏移、變形，細胞核深染，可見到肝竇充血、炎細胞浸潤，各組藥物影響肝細胞脂質沉積、脂肪變性的側重不同。桃紅四物湯使肝臟脂質沉積更局限于中央靜脈周圍，同時可以減少肝細胞脂肪變性的面積;二陳湯可降低肝細胞脂肪變性的密度及脂肪空泡的體積，西藥也可降低脂肪變性的密度。

圖1 正常組大鼠肝組織(HE×40)

圖2 模型組大鼠肝組織(HE×40)

圖3 西藥組大鼠肝組織(HE×40)

圖4 二陳湯組大鼠肝組織(HE×40)

圖5 桃紅四物湯組大鼠肝組織(HE×40)

2.2 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織TNF-α、IL-6表達的影響

2.2.1 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織TNF-α表達的影響 圖6表1顯示，正常肝組織內TNF-α陽性表達極少，僅在匯管區(qū)周圍偶見單個陽性表達細胞;模型組大鼠肝組織內TNF-α明顯增多(P<0.01)，肝細胞腫脹變形，陽性表達細胞在匯管區(qū)及大血管周圍分布明顯增多;二陳湯組、桃紅四物湯組大鼠陽性表達細胞數量與模型組比較顯著減少(P<0.01)，對照組與模型組相比無統計學差異。

圖6 不同組大鼠肝組織TNF-α表達的比較(SF二步法×40)

表1 不同組大鼠肝組織TNF-α表達的比較

表1 不同組大鼠肝組織TNF-α表達的比較

注:與正常組比較:＊＊P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01

組別 樣本量n(只)平均陽性面積Area(×104μm2)積分光密度SumDensity(×104)正 常 組12 0.04±0.05 0.02±0.03模 型 組 13 5.71 ±2.70＊＊ 4.02±2.04＊＊對 照 組 15 5.18±1.89 3.43±1.23二 陳 湯 組 15 4.16±2.33▲▲ 2.73±1.50▲▲桃紅四物湯組 15 4.23±1.78▲▲ 2.72±1.13▲▲

2.2.2 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織IL-6表達的影響 圖7表2顯示，正常肝組織內IL-6陽性表達極少，僅在匯管區(qū)周圍偶見單個陽性表達細胞;模型組大鼠肝組織內IL-6陽性表達區(qū)域明顯增多(P<0.01)，肝細胞腫脹變形，陽性表達細胞在匯管區(qū)及大血管周圍分布明顯增多;對照組、二陳湯組、桃紅四物湯組大鼠肝組織陽性表達細胞數量與模型組相比較明顯減少(P<0.01)。

2.3 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織 TNF-α、IL-6含量的影響

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比，二陳湯組大鼠肝組織 IL-6含量明顯下降(P<0.05)，TNF-α含量無明顯下降;桃紅四物湯組大鼠肝組織TNF-α、IL-6含量無明顯下降;西藥對照組大鼠肝組織TNF-α含量明顯下降(P<0.05)，IL-6含量無明顯下降。

圖7 不同組大鼠肝組織IL-6表達的比較(SF二步法×40)

表2 不同組大鼠肝組織IL-6表達的比較

表2 不同組大鼠肝組織IL-6表達的比較

注:與正常組比較:＊＊P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01

組別樣本量n(只)平均陽性面積Area(×104μm2)積分光密度SumDensity(×104)正 常 組12 0.045±0.043 0.033±0.032模 型 組 13 8.620 ±4.006＊＊ 6.734 ±3.077＊＊對 照 組 15 3.260±2.198▲▲ 2.515±1.697▲▲二 陳 湯 組 15 5.040±1.834▲▲ 3.897±1.435▲▲桃紅四物湯組 15 4.000±1.742▲▲ 3.067±1.351▲▲

表3 不同組大鼠肝組織TNF–α、IL-6含量的比較

表3 不同組大鼠肝組織TNF–α、IL-6含量的比較

注:與正常組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與模型組比較:▲P<0.05

組別 樣本量n(只)IL-6含量(pg/ml)TNF-α 含量(pg/ml)正 常 組12 17.309± 9.314 6.450±3.045模 型 組 13 39.431±23.985＊＊ 10.567±3.120*對 照 組 15 34.865± 7.714 6.362±3.569▲二 陳 湯 組 15 26.389±4.588▲ 7.928±1.715桃紅四物湯組15 28.409± 5.609 8.636±1.579

3 討論

3.1 TNF-α、IL-6與 NAFLD 的關系

研究證實，IR是NAFLD的基本特征，其可以直接或間接促進肝脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥和纖維化的發(fā)生。TNF-α、IL-6是已知的細胞因子中與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關系最為密切的介質之一。臨床研究發(fā)現，患者血清 TNF-α、IL-6水平與胰島素抵抗指數(H0MA-IR)均呈顯著性正相關，與是否合并代謝綜合征呈顯著性相關[7]，證明 TNF-α、IL-6通過誘導IR對NAFLD疾病本身的發(fā)生與發(fā)展起重要作用。TNF-α是腫瘤壞死因子家族中的重要一員，其通過肝細胞上TNF-α受體影響肝細胞脂肪代謝，降低胰島素受體絡氨酸激酶的活性，從而加重IR并與NAFLD的發(fā)生密切相關[8]。TNF-α既能直接損傷肝細胞，與肝細胞膜上的受體結合，誘導肝細胞死亡，又能增加肝內活性氧(ROS)產生，通過誘發(fā)炎癥介質激活中性粒細胞等產生間接作用，加重肝細胞炎癥、損傷。致炎因子IL-6是多種細胞如單核吞噬細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞和激活的 T淋巴細胞等對IL-1和TNF-α反應的產物，IL-6主要作用于肝細胞和B淋巴細胞，刺激肝細胞合成纖維蛋白原等幾種血清蛋白，是活化的B淋巴細胞分化晚期的主要刺激因子。有研究顯示，胰島素依賴的AKT 的激活，明顯被 IL-6 抑制[9]。

本實驗發(fā)現，四氯化碳聯合高脂飼料復制的NASH大鼠肝組織發(fā)生明顯的脂肪樣變性及炎癥反應，肝細胞排列紊亂，肝細胞腫脹變形，胞漿內可見脂肪大泡，胞核固縮、偏移，中心靜脈區(qū)及匯管區(qū)有明顯的炎性細胞浸潤，肝組織內 TNF-α、IL-6表達和含量明顯增多，與文獻報道相一致，證明二者參與NAFLD的形成與發(fā)展，其具體機制可能與IR的形成、炎癥反應及肝細胞損傷有關。

3.2 二陳湯與桃紅四物湯對NAFLD的影響

前期實驗發(fā)現，二陳湯與桃紅四物湯能夠改善NAFLD大鼠的 IR 狀態(tài)，降低 ALT、AST、TBA、TBIL等指標。通過上述方藥對NAFLD大鼠治療作用的進一步研究發(fā)現，二陳湯與桃紅四物湯能夠抑制肝組織內過度表達的 TNF-α、IL-6，從而干預IR的形成，調整糖脂代謝紊亂，影響“第一次打擊”過程，同時又能減輕肝組織氧化應激反應，起到保護肝細胞功能和改善肝損傷的作用，對“第二次打擊”進行干預。兩方比較，二陳湯的作用效果優(yōu)于桃紅四物湯。

二陳湯首見于《太平惠民和劑局方》，治“痰飲為患，或嘔吐惡心，或頭眩心悸，或中脘不快，或發(fā)為寒熱，或因食生冷，脾胃不和”。其組成為半夏、橘紅、茯苓、炙甘草4藥共奏燥濕化痰、健脾滲濕、行氣祛痰之效。后世醫(yī)家多以本方為治療痰飲的主方，對痰飲引起的諸多病證常以本方為基礎化裁運用。桃紅四物湯由四物湯加桃仁紅花組成，為治療血行瘀滯之良方。方中桃仁、紅花通利脈道，消血中瘀滯，熟地長于滋陰養(yǎng)血，川芎為“血中氣藥”，能行氣而活血;當歸補血活血，赤芍活血祛瘀，甘草調和諸藥，全方合為養(yǎng)血活血化瘀之方，王清任之血府逐瘀湯、膈下逐瘀湯等皆由桃紅四物湯化裁而來。選用上述化痰與活血之基礎方，意在以方測法，探討化痰法與活血法對NAFLD大鼠的作用效果與作用靶點，進一步以法測證，揭示NAFLD的病機關鍵。根據實驗結果得知，化痰之基礎方二陳湯作用較桃紅四物湯更為確切，以此推斷以肝組織炎癥表現為特征的NASH階段，中醫(yī)辨證應為痰瘀互結，以痰為主。

3.3 化痰法治療NAFLD有其階段性

根據NAFLD痰瘀互結的理論，臨床上應以化痰祛瘀為法選方用藥。而中醫(yī)的治療優(yōu)勢在于辨證論治，即同病異治，針對脂肪肝發(fā)展的不同階段調整治法用藥，因此化痰祛瘀法的應用也應有其側重。學習文獻和運用現有中醫(yī)理論分析，NASH階段的患者表現為痰濕內停、濕熱蘊結，此時用藥應以祛濕化痰為主。本實驗也證實，處在NASH階段大鼠對化痰基礎方二陳湯的治療更加敏感，反證了該階段的病理基礎以痰飲為主，為NAFLD中期治療應以祛濕化痰為主提供了理論依據。NASH得不到控制，病情就會向肝纖維化發(fā)展，患者表現也多以口黏、納差乏力、脘腹痞滿、肝區(qū)脹悶疼痛、肝脾腫大變硬、舌質瘀暗或見瘀點瘀斑、舌下脈絡瘀滯、脈細澀等瘀血內停證為主，此時治療應施以化痰散結活血通絡之法。正所謂“痰為瘀之漸，瘀為痰之變”，這也解釋了為何本實驗觀察發(fā)現活血基礎方桃紅四物湯對細胞因子的調節(jié)作用不如二陳湯的機理。若探究化痰法與活血法應用的具體時間點，還需進一步的實驗探討。

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