李 健，譚 勇，呂永恒，何小鵑，鞠大宏，呂愛平△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)系，北京 100029;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.天津市南開理療醫(yī)院，天津 300100;4.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglycoside，GTW)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)臨床治療的“二線”首選藥物，但其明確的生殖毒性在很大程度上限制了該藥的臨床應(yīng)用[1、2]。有中藥學(xué)專家指出，中藥的毒副作用是隨著機(jī)體狀態(tài)或疾病狀態(tài)而變化的。一些中藥可能對正常生理狀態(tài)的機(jī)體有毒副作用，而可能對病理狀態(tài)的機(jī)體沒有或僅出現(xiàn)輕微的毒副作用[3、4]。為了證明上述觀點(diǎn)，本研究以正常雄性SD大鼠(健康狀態(tài))及弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠(發(fā)病狀態(tài))為研究對象，比較觀察了GTW對2種不同機(jī)能狀態(tài)大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及NOS表達(dá)的影響，以期為針對中醫(yī)證候的中藥毒性評價思路提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠NOS檢測試劑盒T-NOS(A014-2)購自南京建成生物工程研究所，雷公藤多苷片購自江蘇美通制藥有限公司(生產(chǎn)批號080717)，弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司，NOS一抗購自美國Santa Cruz生物公司(Sc-58399)，其他試劑及相關(guān)實(shí)驗(yàn)耗材購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 動物及處置方法

雄性SD大鼠100只160g±20g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證號 SCXK-軍-2007-004。動物隨機(jī)分為正常組(40只)和AA組(60只)2組。AA大鼠的制備方法按照本課題組的常規(guī)方法進(jìn)行[5]，2周后根據(jù)關(guān)節(jié)炎評分量表篩選得到病理特征明顯的AA大鼠40只組成AA發(fā)病組。正常及AA大鼠各自隨機(jī)分成4組(每組10只):溶劑對照組(生理鹽水)、GTW低劑量組(7mg/kg體重)、GTW中劑量組(70mg/kg體重)和 GTW高劑量組(105mg/kg體重)，灌胃給藥(1次/d，連續(xù)2周)。給藥劑量按人臨床常用量換算(大鼠系數(shù)為7)。

1.3 睪丸及附睪系數(shù)測定

準(zhǔn)確稱量大鼠體重及睪丸、附睪的重量，計(jì)算臟器、體重的比值。

1.4 睪丸組織勻漿T-NOS測定

準(zhǔn)確稱取大鼠睪丸組織，組織勻漿器勻漿，3000rpm離心10min，取上清，化學(xué)比色法測定上清中T-NOS的含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑說明書。

1.5 睪丸組織石蠟切片HE染色

睪丸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及 HE染色，光鏡觀察并攝片。

1.6 睪丸組織冰凍切片NOS免疫組化顯色

睪丸組織經(jīng)OCT包埋、冰凍切片、S-P法免疫組化染色、DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染，光鏡觀察、攝片。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

組內(nèi)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用廣義線性模型兩因素方差分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA大鼠模型的評價

AA模型制備的結(jié)果與本課題組前期實(shí)驗(yàn)完全符合，具有高度重復(fù)性[5]。圖1顯示，佐劑注射1 d后，致炎側(cè)關(guān)節(jié)明顯紅腫，隨時間延長腫脹程度加劇;繼發(fā)側(cè)自佐劑注射后3周腫脹明顯并呈緩慢增高的趨勢，表明佐劑性關(guān)節(jié)炎模型制備成功。

圖1 弗氏完全佐劑誘導(dǎo)SD大鼠關(guān)節(jié)腫脹的變化趨勢(n=10)

2.2 GTW對睪丸及附睪系數(shù)的影響

各組大鼠體重及睪丸、附睪重量經(jīng)精確稱量。圖2顯示，與溶劑對照組比較，GTW高劑量處理大鼠睪丸系數(shù)均呈顯著減小的趨勢(P<0.01)，而各組附睪系數(shù)沒有顯著性差異(P>0.05)。多元分析結(jié)果表明，正常組與AA發(fā)病組比較，睪丸及附睪系數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 GTW對大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖3顯示，正常組溶劑對照大鼠睪丸組織著色均勻，生精小管結(jié)構(gòu)清晰，各級生精細(xì)胞排布規(guī)律，精子細(xì)胞及精子數(shù)量較多。與之比較，GTW低劑量處理大鼠睪丸組織沒有明顯的病理改變;GTW中、高劑量處理大鼠睪丸生精小管的生精上皮明顯變薄，細(xì)胞層次紊亂，部分生精細(xì)胞腫脹或空泡化，精子細(xì)胞及精子數(shù)量明顯減少。圖4顯示，與之比較，AA發(fā)病組中只有GTW高劑量處理大鼠睪丸組織出現(xiàn)較明顯病理改變外，其他各組大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常，沒有明顯的病理變化。

圖2 各組大鼠附睪系數(shù)(A)及睪丸系數(shù)(B)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=10)

圖3 不同劑量GTW對正常大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，HE染色，×100

圖4 不同劑量GTW對AA大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(HE染色×100)

2.4 睪丸組織中T-NOS含量測定

與正常組溶劑對照大鼠比較，GTW高劑量處理大鼠睪丸組織中T-NOS含量顯著減少(P<0.05);與AA發(fā)病組溶劑對照大鼠比較，GTW低劑量處理大鼠睪丸組織中T-NOS含量顯著增加(P<0.05)。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，AA發(fā)病組大鼠睪丸組織中T-NOS含量顯著高于正常組大鼠(P<0.05，圖5)。NOS抗體免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示:正常對照大鼠睪丸組織中NOS陽性反應(yīng)明顯，陽性細(xì)胞較多(圖6-E);與之比較，GTW處理大鼠睪丸組織中NOS陽性反應(yīng)減弱，陽性細(xì)胞減少(圖6-F)。AA發(fā)病組溶劑對照大鼠睪丸組織 NOS呈高表達(dá)(圖6-e);與之比較，GTW處理大鼠睪丸組織NOS亦呈強(qiáng)陽性(圖6-f)。

圖5 不同劑量GTW對正常大鼠及AA大鼠睪丸組織總NOS水平的影響(n=10)

圖6 睪丸組織冰凍切片pananti-NOS免疫組化(DAB顯色，×100)

3 討論

雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglycoside，GTW)中含有多種生物活性組分，如生物堿、二萜、三萜類等多種化學(xué)組分，具有祛風(fēng)除濕、消腫、舒筋通絡(luò)等功效。上世紀(jì)80年代，雷公藤多苷被開發(fā)為中成藥(雷公藤多苷片)進(jìn)入臨床，主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎、原發(fā)或繼發(fā)性腎小球腎炎、哮喘等免疫相關(guān)性疾病。GTW治療RA的初步藥理機(jī)制是通過抗炎和免疫抑制作用，糾正T細(xì)胞亞群分布紊亂及多種炎癥介質(zhì)釋放[1]。然而，GTW在臨床使用的過程中也伴隨著不同程度的毒副作用，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、肝功能異常及生殖毒性等[2]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[6、7]，GTW能顯著抑制精子細(xì)胞及精子的形成，抑制睪丸組織中一氧化氮合酶(NOS)的合成，進(jìn)而影響NO的生成和調(diào)控，導(dǎo)致精子發(fā)生受阻或發(fā)育停滯。為此，探討GTW毒副作用與機(jī)體病理生理狀態(tài)等因素的關(guān)系，了解其毒副作用形成的特點(diǎn)及規(guī)律是該藥臨床應(yīng)用及二次開發(fā)的關(guān)鍵問題。

事實(shí)上，雷公藤抗男性生育的作用早為人知(計(jì)劃生育專家擬將其開發(fā)為男性避孕藥)，是該藥毒副作用研究不可回避的問題。本實(shí)驗(yàn)比較觀察了高、中、低3個劑量GTW對正常生理狀態(tài)及佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎病理狀態(tài)大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及NOS表達(dá)的影響。結(jié)果表明，GTW對2組大鼠的睪丸及附睪系數(shù)沒有影響。GTW低劑量(臨床等效劑量)對2組動物睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均無顯著影響;GTW中劑量(約臨床用量10倍)可導(dǎo)致正常大鼠睪丸組織生精上皮細(xì)胞層次紊亂和細(xì)胞腫脹，然而該劑量對關(guān)節(jié)炎發(fā)病狀態(tài)大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并無明顯影響。若用高劑量(約臨床用量的15倍)處理動物，正常及AA發(fā)病組大鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均有明顯改變，生精小管萎縮、生精上皮變薄、精子細(xì)胞及精子數(shù)量減少。組織病理學(xué)結(jié)果提示，超高劑量GTW具有明顯睪丸毒性，而在一定劑量范圍內(nèi)，正常大鼠表現(xiàn)出一定程度的睪丸毒性，而AA發(fā)病狀態(tài)大鼠睪丸毒性相對輕微。已有研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織中NO的含量與雄激素分泌關(guān)系密切，并對精子成熟、獲能、運(yùn)動等生殖功能發(fā)揮調(diào)控作用[8、9]。NO是由NOS在NADPH-II作用下催化 L-精氨酸而產(chǎn)生的，組織中NOS的水平及活性可間接反應(yīng)NO的含量?；诖耍緦?shí)驗(yàn)檢測了2組大鼠睪丸組織中總NOS的水平。多因素方差分析結(jié)果顯示，與正常組比較，關(guān)節(jié)炎發(fā)病組大鼠睪丸組織中NOS的水平相對較高，且差異顯著。NOS抗體免疫組化顯色結(jié)果驗(yàn)證了上述結(jié)論，即GTW可能抑制了正常大鼠睪丸組織中NOS的表達(dá)，從而影響精子細(xì)胞及精子的生成。該結(jié)果提示，動物在健康態(tài)及AA發(fā)病態(tài)GTW的睪丸毒性存在顯著差異。綜上，一方面GTW的睪丸毒性與劑量相關(guān):臨床等效劑量不存在睪丸毒性，較大劑量可誘發(fā)睪丸毒性;另一方面，GTW的睪丸毒性與機(jī)體生理狀態(tài)相關(guān):與正常組比較，相同劑量GTW在AA發(fā)病大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的睪丸毒性相對較弱。

目前，對雷公藤毒性及毒理學(xué)的研究報道已有很多，但大多襲用了現(xiàn)代毒理學(xué)的研究思路和方法，所獲得的數(shù)據(jù)多來自于正常動物，所研究的是藥物對正常機(jī)體的毒性作用，缺乏中醫(yī)藥的自身特色[10]。眾所周知，中藥須在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的使用，臨床應(yīng)用過程中具有辨證用藥、配伍解毒、中病即止的特點(diǎn)[11]?！端貑枴ちo(jì)大論》有:“婦人重身，毒之何如……有故無殞，亦無殞也”的記載。文中雖然表面上討論的是妊娠期用藥問題，但實(shí)質(zhì)闡述的是中醫(yī)對中藥藥性與毒性關(guān)系的認(rèn)識，強(qiáng)調(diào)了“藥-證”密不可分的道理。古代醫(yī)家把中藥的“毒性”及機(jī)體的“不健康狀態(tài)”理解為“偏性”。中藥的治療原理在于“以偏糾偏”，當(dāng)藥物糾“偏”時表現(xiàn)為治療效應(yīng)，而當(dāng)機(jī)體無“偏”時則表現(xiàn)為毒性。上世紀(jì)90年代，日本發(fā)生了小柴胡湯濫用引發(fā)間質(zhì)性肺炎的事件就是“有故無殞”理論的典型例證[3]。

誠然，中藥毒理機(jī)制十分復(fù)雜，與機(jī)體代謝過程、生理狀態(tài)、作用靶點(diǎn)等密切關(guān)聯(lián)。但要真正揭示中藥毒理機(jī)制需借助功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等技術(shù)手段，并結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法。本課題組目前正在開展證候動物模型，以及附子、雷公藤等有毒中藥對不同證候、不同生理狀態(tài)動物生物標(biāo)志物(biomarker)、代謝輪廓(metabolic profile)影響的研究，期望獲得更有說服力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為適合中醫(yī)藥特點(diǎn)的“中藥毒理學(xué)”研究提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的證據(jù)及思路。

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