袁衛(wèi)玲，馬淑然，郭霞珍，顧曉靜，徐巍華，趙樹宏(.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 30093;.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 0009)

根據(jù)中醫(yī)天人相應(yīng)理論，自然界的季節(jié)變化對(duì)人體的生理病理具有重要的影響作用。現(xiàn)代生物學(xué)研究也表明，人體內(nèi)存在一種受到光照調(diào)節(jié)并具有高位調(diào)控作用的組織-松果腺，它分泌的褪黑素(Melatonin，簡(jiǎn)稱Mel)通過視覺和皮膚兩條生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使其分泌與太陽光的運(yùn)動(dòng)同步，具有晝夜和季節(jié)性節(jié)律。Mel具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，不僅影響免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，而且對(duì)體液和細(xì)胞免疫均起到調(diào)節(jié)作用。研究表明，Mel與肺臟免疫密切相關(guān)[1]，它與肺組織上分布的褪黑素受體(Melatonin receptor，簡(jiǎn)稱MR)結(jié)合，由G蛋白介導(dǎo)，通過級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)對(duì)第一、第二等信號(hào)物質(zhì)發(fā)揮作用，對(duì)肺部免疫直接產(chǎn)生影響。此外，Mel的自由基清道夫和抗氧化劑活性作用，能降低其調(diào)控的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶活性及支氣管肺泡灌洗液中一氧化氮含量，減輕哮喘大鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[2]。由于松果腺-褪黑素既具有季節(jié)性節(jié)律，又能對(duì)肺臟免疫產(chǎn)生直接或間接調(diào)節(jié)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用松果腺摘除動(dòng)物模型，通過觀測(cè)大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中免疫相關(guān)物質(zhì)的變化，來探討松果腺對(duì)大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化影響的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康Wistar大鼠 SPF級(jí)，雄性96只，體重160g±10g，分別于春分、秋分、夏至、冬至前40d由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購入，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2007-0002。飼養(yǎng)條件:自然光照(不加人工照明)，室溫、濕度自然，自由攝取水及飼料。

1.2 主要儀器和試劑

低溫高速離心機(jī)(美國 BECKMAN公司產(chǎn))，PW2003型培養(yǎng)箱(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠)，307-2B型牙科臺(tái)式電鉆機(jī)(上海醫(yī)療器械廠)，BIO RAD 550酶標(biāo)儀(美國博樂公司產(chǎn))，OLYMPUS BX5顯微鏡(日本OLYMPUS珠式公社)，Hanks液(購自北京化學(xué)試劑公司)，小牛血清白蛋白(購自北京駿騰生物技術(shù)有限公司)，雞靜脈血(購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)，IL-2、IFN-γ和 sIgA(RD進(jìn)口分裝，均購自北京博惠嘉業(yè)生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 分組

隨機(jī)分為生理組、手術(shù)組(松果腺摘除模型組)和偽手術(shù)組，每組各8只。手術(shù)組、偽手術(shù)組分別于春分、秋分、夏至、冬至(以下簡(jiǎn)稱二分、二至)前1個(gè)月施行手術(shù)造模，與生理組動(dòng)物在相同條件下飼養(yǎng)到二分、二至當(dāng)日20∶00以后處死取材。

2.2 動(dòng)物造模與檢測(cè)方法

2.2.1松果腺摘除動(dòng)物模型 10%水合氯醛3～4ml/kg腹腔注射麻醉、固定、消毒，頭頂皮膚切口約2cm，暴露顱骨矢狀縫和人字縫。在人字縫和矢狀縫兩側(cè)用牙科鉆切割矩形骨片，暴露矢狀靜脈(SSV)和橫向靜脈竇(TS)，沿SSV兩側(cè)縱向切開硬腦膜，雙側(cè)結(jié)扎SSV，剪斷并向后翻轉(zhuǎn)斷端靠近竇匯(CS)端，用眼科鑷摘取出松果腺，把SSV放回原位，放置少許明膠海綿止血、清創(chuàng)，點(diǎn)適量青霉素干粉預(yù)防感染，縫合皮膚并消毒，創(chuàng)口再點(diǎn)適量青霉素干粉。術(shù)后注射青霉素注射液3d。

2.2.2 偽手術(shù)動(dòng)物模型 操作過程同上，只是向后翻轉(zhuǎn)SSV斷端后，不摘除松果腺，也不將鑷子尖端伸入竇匯下，以避免對(duì)松果腺及其神經(jīng)纖維的損傷。

2.2.3 肺泡灌洗液的獲取 分別于二分、二至當(dāng)日20∶00時(shí)，將大鼠麻醉固定，隨即開胸暴露氣管。用棉線結(jié)扎離心端，在其下方2個(gè)軟骨環(huán)間做一切口并插入導(dǎo)管，導(dǎo)管與5ml注射器連接，從支氣管分叉處用棉線結(jié)扎右側(cè)支氣管，用4℃生理鹽水4ml進(jìn)行左肺灌洗，注射器抽吸6遍，回收液約為2ml～2.5ml，將回收液低溫4℃ 2000r/min，離心15min將上清液收集、分裝，－70℃低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞(AM)吞噬功能的測(cè)定 雞紅細(xì)胞吞噬法[3]。

2.2.5 肺泡灌洗液中 IL-2，IFN-γ和 sIgA的測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)均用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析。各季節(jié)組內(nèi)及4季節(jié)每組間比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 松果腺對(duì)大鼠 BALF中 IL-2和 IFN-γ四季含量變化影響的比較

表1顯示，與同一季節(jié)比較，春分時(shí) IL-2和IFN-γ手術(shù)組含量顯著低于生理組(P<0.05)。全年IL-2和IFN-γ偽手術(shù)組與生理組相比，無顯著差異(P>0.05)。

與不同季節(jié)比較，生理組:IL-2春分、夏至高于秋分，差異十分顯著(P<0.01);春分高于冬至，差異十分顯著(P<0.01);夏至顯著高于冬至(P<0.05)。IFN-γ春分、夏至顯著高于秋分和冬至(P<0.05)。手術(shù)組:IL-2夏至顯著高于秋分(P<0.05)，IFN-γ夏至顯著高于春分、秋分和冬至(P<0.05，P<0.01)。

表1 松果腺對(duì)大鼠BALF中IL-2和IFN-γ含量四季變化影響的比較

表1 松果腺對(duì)大鼠BALF中IL-2和IFN-γ含量四季變化影響的比較

注:與同一季節(jié)生理組比較:*P<0.05;與同組春分比較:★P<0.05;與同組秋分比較:#P<0.05，##P<0.01;與同組冬至比較:△P<0.05，△△P<0.01

季節(jié)n IL-2 IFN-γ生理組 手術(shù)組 偽手術(shù)組 生理組 手術(shù)組 偽手術(shù)組春分 8 102.937±20.764##△△ 74.217±23.774*94.443±22.373 131.452±27.235#△ 102.489±15.288*125.910±29.270夏至 8 92.848±14.515##△ 85.775±14.752#75.116±25.849 128.723±28.390#△ 126.921±24.056★#△△123.472±25.715秋分 8 63.794± 6.509 66.582± 8.099 74.937±20.150 95.516±15.931 100.370±18.316 112.207±14.185冬至 8 73.137±17.856 69.445± 9.502 77.848±10.71096.029±30.015 90.748±18.201 99.246±23.476

3.2 松果腺對(duì)大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季變化影響的比較

表2顯示，與同一季節(jié)比較，春分時(shí)，sIgA手術(shù)組顯著低于生理組和偽手術(shù)組(P<0.05);秋分時(shí)，手術(shù)組、生理組顯著低于偽手術(shù)組(P<0.05，P<0.01);除秋分外，其余3季生理組與偽手術(shù)組相比，無顯著差異(P>0.05)。夏至?xí)r，AM吞噬率手術(shù)組顯著低于生理組(P<0.05);冬至?xí)r，手術(shù)組顯著低于偽手術(shù)組(P<0.05);全年AM吞噬率偽手術(shù)組與生理組相比，無顯著差異(P>0.05)。

與不同季節(jié)比較，生理組:sIgA秋分低于春分和夏至，差異極顯著(P<0.01);冬至顯著低于春分和夏至(P<0.05)。偽手術(shù)組:sIgA冬至顯著低于春分(P<0.05)。手術(shù)組:sIgA春分顯著低于夏至(P<0.05);秋分、冬至低于夏至，差異極顯著(P<0.01)。

表2 松果腺對(duì)大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季變化影響的比較

表2 松果腺對(duì)大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季變化影響的比較

注:與同一季節(jié)生理組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與同一季節(jié)偽手術(shù)組比較:#P<0.05;與同組春分比較:☆P<0.05;與同組夏至比較:★P<0.05，★★P<0.01;與同組秋分比較:△△P<0.01;與同組冬至比較:▲P<0.05

季節(jié)n sIgA(pg/ml)AM吞噬率(%)生理組 手術(shù)組 偽手術(shù)組 生理組 手術(shù)組 偽手術(shù)組春分 8 5.619±1.000△△▲ 3.925±0.775*#★ 5.405±1.530 39.480±13.532 37.276±13.536 36.436±15.084夏至 8 5.494±1.362△△▲ 5.183±0.850 5.061±1.498 45.306±10.821 32.885± 5.656* 36.430±12.797秋分 8 2.974±1.072 3.311±0.499#★★ 4.795±1.211＊＊ 37.795±11.837 34.892±10.265 44.597±11.735冬至 8 3.817±1.114 3.615±1.126★★ 3.893±1.0641☆ 38.480±11.891 33.566± 7.571#48.108± 8.466

4 討論

4.1 松果腺對(duì)大鼠肺臟免疫調(diào)節(jié)以增強(qiáng)為主

考慮到松果腺摘除手術(shù)操作過程可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，如應(yīng)激反應(yīng)，故專門設(shè)立偽手術(shù)組以作對(duì)照。由于松果腺分泌的Mel不僅具有季節(jié)節(jié)律，還有晝夜節(jié)律，血液Mel含量白天低而夜間高，且最高含量值出現(xiàn)在凌晨2∶00～3∶00，為了使手術(shù)組和偽手術(shù)組更明顯、更準(zhǔn)確地與生理組比較，故在二分、二至當(dāng)日20∶00后取材。

在細(xì)胞免疫中，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)主要由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生，它的生物活性是刺激多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，包括T淋巴細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞(NK細(xì)胞)的增殖，促進(jìn)活化的B細(xì)胞分化、增生和分泌免疫球蛋白，同時(shí)也通過作用于單核細(xì)胞，促進(jìn)其分泌 IL-1。有研究顯示[4、5]，在慢性支氣管炎動(dòng)物模型中肺組織和外周血中IL-2含量明顯降低。另一重要的細(xì)胞因子 γ-干擾素(IFN-γ)具有干擾病毒感染和復(fù)制的能力，它主要能活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，可直接促進(jìn)T、B細(xì)胞分化和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)成熟，刺激B細(xì)胞分泌抗體，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用。由于呼吸道感染的病原中病毒占重要地位，故IFN-γ的特異性防御機(jī)制極為重要。在體液免疫中分泌型IgA(sIgA)是呼吸道黏膜的主要保護(hù)性抗體，也是機(jī)體抗感染的一道重要的“屏障”，能阻止細(xì)菌附著在黏膜的表面溶解細(xì)菌，并可中和病毒和毒素。在肺臟的非特性免疫功能中肺泡巨噬細(xì)胞(AM)較強(qiáng)的吞噬殺傷能力，可非特異性吞噬殺傷多種病原微生物，在人體防御各種各樣的致病因素入侵的過程中發(fā)揮極其重要的作用。AM主要分布于呼吸道、肺泡表面，約占BALF細(xì)胞總數(shù)的90%以上。肺臟具有不斷暴露于外界異物侵入的特殊性，AM吞噬功能的強(qiáng)弱則與肺部感染密切相關(guān)。由于 IL-2、IFN-γ、sIgA和 AM與肺臟免疫關(guān)系密切，故本實(shí)驗(yàn)選取IL-2和IFN-γ反映肺臟的細(xì)胞免疫功能，sIgA反映體液免疫功能，AM吞噬率代表非特異性免疫功能。

本研究結(jié)果顯示，正常生理情況下，全年大鼠BALF中 IL-2、IFN-γ、sIgA含量和 AM 吞噬率均呈現(xiàn)春夏高于秋冬的變化趨勢(shì)，而偽手術(shù)組 IFN-γ和sIgA含量也呈現(xiàn)春夏高于秋冬的變化特點(diǎn)，與生理組變化一致。另外除sIgA秋分外，其余指標(biāo)生理組與偽手術(shù)組四季比較無顯著性差異，說明本實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作過程基本不影響B(tài)ALF中相關(guān)免疫物質(zhì)含量的變化。

摘除松果腺后，BALF中AM吞噬率四季數(shù)值雖均較生理組有下降的變化特點(diǎn)，其中夏至手術(shù)組比生理組顯著降低。IL-2、IFN-γ和sIgA含量，除秋分時(shí)數(shù)值略升高外，其余3個(gè)季節(jié)數(shù)值均較生理組有下降的趨勢(shì)。其中春分、冬至?xí)r，手術(shù)組IL-2、IFN-γ和sIgA含量低于生理組和偽手術(shù)組，以IL-2和IFN-γ含量顯著低于生理組(P<0.05)，sIgA含量顯著低于生理組和偽手術(shù)組(P<0.05)。雖然這3個(gè)指標(biāo)在秋分時(shí)摘除松果腺手術(shù)組較生理組數(shù)值升高，但手術(shù)組與生理組、偽手術(shù)組之間無顯著性差異，僅僅有略升高的變化趨勢(shì)而已。這種升高可能是季節(jié)性因素造成的，亦可能是大鼠對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷的應(yīng)激性反應(yīng)?？梢?，松果腺對(duì)BALF中免疫相關(guān)物質(zhì)調(diào)節(jié)以增強(qiáng)作用為主。

4.2 松果腺對(duì)大鼠肺臟免疫調(diào)節(jié)具有季節(jié)選擇性

摘除松果腺手術(shù)后，BALF中 IL-2、IFN-γ和sIgA含量除秋分時(shí)數(shù)值略升高外，其余3個(gè)季節(jié)數(shù)值均較生理組有下降的特點(diǎn)，以春分時(shí)顯著(P<0.05)，說明松果腺在春分時(shí)對(duì) IL-2、IFN-γ和 sIgA的免疫上調(diào)作用顯著。而AM吞噬率四季手術(shù)組數(shù)值均較生理組有下降的特點(diǎn)，以夏至?xí)r顯著(P<0.05)，說明松果腺在夏至?xí)r對(duì)AM有顯著的免疫上調(diào)作用。可見，松果腺在不同的季節(jié)對(duì)免疫物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用不完全一致，它對(duì)大鼠肺臟免疫調(diào)節(jié)功能可能具有季節(jié)選擇性，這也與我們前期研究結(jié)論相吻合[6]。但松果腺對(duì)不同免疫物質(zhì)季節(jié)選擇性的具體調(diào)節(jié)免疫機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

4.3 松果腺對(duì)大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化的影響具有復(fù)雜性

全年生理組大鼠 BALF中 IL-2、IFN-γ、sIgA含量和AM吞噬率存在春夏高于秋冬的季節(jié)節(jié)律性，但松果腺摘除后除 AM吞噬率外，IL-2、IFN-γ和sIgA含量仍表現(xiàn)為春夏高于秋冬的變化特點(diǎn)，只是生理組以春分含量最高為顯著，而手術(shù)組以夏至含量最高為顯著，但生理組與手術(shù)組的整體變化趨勢(shì)提示松果腺對(duì)大鼠肺臟免疫功能季節(jié)性變化的影響不具有惟一性。分析其原因可能為，松果腺雖然主要分泌褪黑素，但不是內(nèi)源性褪黑素的惟一來源。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜、卵巢、腎上腺、睪丸、周圍神經(jīng)、交感神經(jīng)、腦垂體和甲狀腺等組織中亦有表達(dá)。將實(shí)驗(yàn)大鼠松果腺摘除后，血內(nèi)仍可測(cè)得褪黑素，說明尚有次級(jí)分泌來源[7]。而本實(shí)驗(yàn)摘除松果腺后大鼠肺臟免疫功能仍部分存在著春夏高于秋冬的季節(jié)節(jié)律性，表明除松果腺外，可能有其他內(nèi)源性褪黑素的分泌影響著肺臟的免疫功能。

由本實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，松果腺作為“授時(shí)因子”，能感受光照刺激，高位調(diào)節(jié)人體免疫功能，但對(duì)肺臟局部免疫調(diào)節(jié)并非在每個(gè)季節(jié)對(duì)每個(gè)指標(biāo)都有影響，且在不同的季節(jié)調(diào)節(jié)作用不一致，不能單一地概括為上調(diào)或下降，因此松果腺對(duì)肺臟免疫功能季節(jié)性變化調(diào)節(jié)不具有惟一性而較復(fù)雜。但總體上來看，松果腺對(duì)機(jī)體肺臟局部免疫以上調(diào)作用為主。除光照外，溫度、濕度等其他外界因素也影響著松果腺分泌Mel的生理效應(yīng)，進(jìn)而影響肺臟免疫功能。肺臟免疫功能季節(jié)性變化節(jié)律的形成受影響的因素非常多，Mel作為神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，與肺臟免疫有十分密切的聯(lián)系，兩者之間的節(jié)律性變化是否有某種內(nèi)在緊密聯(lián)系，其間相關(guān)性和作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。

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