甘國興，莫新民△，李勁平，張國民，范娟娟，劉仕杰

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410007;2.中南大學藥學院，湖南 長沙 410013)

原發(fā)性骨質疏松癥(Osteoporosis OP)是一種全身性骨骼疾病，已成為影響老年人身體健康和生活質量的嚴重社會問題。壯骨止痛膠囊是由壯骨止痛方依據(jù)中醫(yī)理論結合現(xiàn)代藥理研究研制而成，具有補益肝腎、壯骨止痛功效，能有效治療骨質疏松癥，已獲得國家新藥證書(國藥證字Z20050125)。為明確其藥效成分及其作用機理，我們課題組用不同溶劑從壯骨止痛方藥中提取了6個部位，現(xiàn)在將水提B部位的療效及其可能的作用機制報告如下。

1 材料

1.1 動物與飼料

3月齡SD雌性大鼠75只，體重250g左右，SPF級，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)2008－0002。飼料由標準普通飼料湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑

壯骨止痛方水提B部位及壯骨止痛方(原材料購自九芝堂，由中南大學藥學院天然藥物化學系制備)、雌激素(HY-032)、PTH(HY-105)、CT(HY-085)、BGP(HY-084)放免試劑盒(北京華英生物技術研究所)。

1.3 主要儀器

Unigamma骨密度儀(意大利)、JY3002型電子天平、低溫離心機、LEICA DM LB2型雙目顯微鏡、超低溫冰箱、萬能力學儀、MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)、Motic B5顯微攝像系統(tǒng)、GC-1500 r放射免疫計數(shù)器、JEOL-1230型透射電鏡(日產(chǎn))等。

2 方法

2.1 分組及造模方法[1]

采用國內(nèi)外公認的雌性大鼠去卵巢3個月造成絕經(jīng)后骨質疏松癥病理模型。大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分出空白組和假手術組各15只，除空白組外，其余的用2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)麻醉，在無菌條件下從距離大鼠胸腰椎外側1cm處縱向切開皮膚及兩側肌肉，摘除雙側卵巢，假手術組僅在卵巢周圍切除相應重量的脂肪，分兩層縫合傷口并用生理鹽水擦洗干凈血跡，術后連續(xù)3d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠4萬u/d，術后5d拆線，飼養(yǎng)于室溫23℃ ～25℃、相對濕度40% ～60%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水。術后1周將模型大鼠隨機分為模型組、壯骨止痛方組、水提B部位組，加上假手術組和空白組共5組，每組15只。

2.2 給藥方法

各組均從第5天拆線后開始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)13周?？瞻捉M、假手術組和模型組每天灌胃相應體積冷開水和油中王牌植物油，其余各組開始灌胃相應藥物(水相 0.6 ml/100g·d，油相0.4ml/100g·d)。劑量按各藥效相關物質相對壯骨止痛方的得率及人鼠體表面積折算確定。

2.3 指標檢測

連續(xù)灌胃13周，每10d稱1次體重，13周之后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉后，腹部切口分離腹主動脈，用負壓采血管采血8ml，靜置 2h～3h，3000r/min離心 15min后分離血清，以備放射免疫法檢測相關指標。剖取左右后肢完整的股骨、脛骨及第2～4腰椎，去除上面附著的肌肉組織，保留骨膜并做相關檢查。

2.3.1 子宮稱重 打開腹腔，從子宮與陰道分界處剪斷，仔細分離出雙側子宮，除掉周圍的脂肪組織，用分析天平稱取濕重。

2.3.2 檢測放免法檢測雌激素、PTH、CT、BGP。

主要從植物群落的外貌特征、景觀結構、空間特征、游憩利用現(xiàn)狀4個方面對樣方進行調(diào)研。詳細記錄各個樣方地理位置、植物種類、數(shù)量、特征數(shù)據(jù)(高度、冠幅、胸徑、多蓋度等)、生境條件等。同時根據(jù)植株干、枝、葉的生理性狀評估樹木的生長勢,描繪樣地平面圖,并拍攝照片以作為其平面分布和豎向景觀的有效補充。

2.3.3 骨密度檢測 取右側股骨、T2～T4腰椎骨用濕紗布包裹，送湖南中醫(yī)藥大學附一院骨密度室檢測骨密度。

2.3.4 骨生物力學檢測 取左側脛骨分干凈肌肉，用濕紗布包裹送國防科技大學物理系檢測骨最大彈性應力、最大抗彎強度。

2.3.5 骨組織病理學檢測 取左側股骨，用4%的多聚甲醛固定48h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，送湖南中醫(yī)藥大學病理檢驗中心檢測股骨頭區(qū)域的病理組織形態(tài)學變化，測量股骨頭平均骨小梁密度。

2.3.6 透射電鏡檢測 取右側脛骨分離肌肉，用2.5%的戊二醛固定24h，然后用5%的硝酸脫鈣1周送中南大學電鏡室檢測。

2.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗作為顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 對去勢骨質疏松模型雌鼠子宮濕重影響

表1顯示，與模型組比較，水提 B部位組雌鼠子宮濕重有所增加，但無差異性(P>0.05)。

3.2 對去卵巢雌性骨質疏松模型大鼠骨密度的影響

表2 壯骨止痛方水提B部位對去勢骨質疏松模型雌鼠骨密度的影響

3.3 對去卵巢雌性骨質疏松癥大鼠左后支脛骨生物力學的影響

表3顯示，與模型組相比，水提B部位能夠顯著提高去勢骨質疏松模型雌鼠左后肢脛骨最大應力和最大抗彎強度(P<0.05)，提高骨生物力學性能。

表3 壯骨止痛方水提B部位對去勢骨質疏松模型雌鼠左后肢脛骨生物力學的影響

3.4 對去卵巢雌性骨質疏松癥大鼠血清E2、BGP、PTH、CT 的影響

表4顯示，與模型組比較，壯骨止痛方水提 B部位能夠顯著降低去勢骨質疏松模型雌鼠血清CT(P<0.05)，有升高去勢骨質疏松模型雌鼠血E2的趨勢，但無差異性(P>0.05);血清 BGP、PTH比模型組略高。

表4 壯骨止痛方水提B部位對去勢骨質疏松模型雌鼠血清E2、BGP、PTH、CT的影響

3.5 對去勢骨質疏松模型雌鼠左股骨組織形態(tài)學的影響

附圖顯示，空白組、假手術組動物骨小梁分布均勻，股骨頸梁髓比正常。去卵巢模型組骨小梁稀疏、破壞，骨髓腔擴大，梁髓比明顯下降。壯骨止痛方組和水提B部位組骨小梁密度分布比較均勻，梁髓比基本恢復正常，鏡下可見成骨細胞。

3.5.1 表5顯示，在10×40倍鏡下，通過顯微形態(tài)學計算機網(wǎng)絡系統(tǒng)測量股骨頭骨小梁密度，每張切片取5個視野，取其平均值。

表5 壯骨止痛方水提B部位對去勢骨質疏松模型雌鼠左股骨骨小梁密度的影響

表5提示，壯骨止痛方水提B部位能夠顯著提高去勢骨質疏松模型雌鼠左股骨骨小梁密度，與模型組比較有非常顯著的差異性(P<0.01)，療效不及壯骨止痛方。

3.5.2 電鏡檢查 JEOL-1230型透射電鏡觀察、照片。

結果分析，假手術組骨間質致密，骨細胞內(nèi)部分線粒體存在空泡變性，骨陷窩較小。模型組大部分骨細胞胞核及胞漿濃縮明顯，骨細胞的凸起明顯減少，骨陷窩橢圓形。給藥后，水提B部位組骨細胞核較正常，胞漿濃縮明顯，骨細胞的凸起明顯減少，骨陷窩呈扁橢圓形。壯骨止痛方組骨細胞較正常，骨細胞凸起無明顯改變，骨陷窩明顯縮小呈扁橢圓形。

4 討論

壯骨止痛方水提B部位是淫羊藿等的水提取物。現(xiàn)代藥理研究證明，淫羊藿有增強下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質軸、胸腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素樣作用，能促進骨髓細胞DNA合成，促進組織蛋白質合成及促進骨細胞生長等作用，對破骨細胞有直接的抑制作用，因而能對抗動物去卵巢、去睪丸及長期大劑量服用腎上腺皮質激素所引起的骨質疏松癥。有促進骨形成防止骨丟失，升高骨密度，改善骨生物力學性能和骨小梁形態(tài)結構的作用。有文獻報道，淫羊藿水提液能夠促進骨髓基質中的成骨細胞表達 TGF-B1，并抑制 TNF-α的表達，間接抑制骨吸收[2];可抑制骨髓細胞誘導破骨細胞的形成，從而減少破骨細胞的產(chǎn)生。淫羊藿可能通過下調(diào)這些骨調(diào)節(jié)相關細胞因子，抑制破骨細胞的形成，而淫羊藿同時還能夠直接促進破骨細胞的凋亡[3]。在淫羊藿作用下，破骨細胞的生成、分化成熟受阻及凋亡增加，最終阻止了由雌激素水平下降引起的骨代謝失衡，維持了骨質中的骨量和骨小梁的形態(tài)，防止了骨質疏松癥的發(fā)生[4]。

本實驗中，與假手術組和空白組比較，模型鼠股骨和腰椎骨密度都明顯下降，差異有顯著或非常顯著意義(P<0.05或 P<0.01);血清 E2含量明顯下降(P<0.01);骨小梁稀疏、破壞，骨髓腔擴大，梁髓比明顯下降，說明絕經(jīng)后骨質疏松癥病理模型復制成功。給藥后與模型組比較，水提B部位組骨密度增加非常明顯，骨生物力學性能提高，骨小梁密度分布比較均勻，梁髓比基本恢復正常，鏡下可見成骨細胞，說明壯骨止痛方水提B部位對骨質疏松癥有良好療效。與空白組和假手術組比較，模型組血清BGP、PTH均明顯升高(P<0.01)，血清CT也有升高的趨勢，血清E2含量明顯下降(P<0.01)，表明去勢后模型鼠雌激素缺乏或不足，骨轉換加快，導致高轉換型骨質疏松發(fā)生。與模型組比較，水提B部位能夠顯著降低去勢骨質疏松模型雌鼠血清CT(P<0.05)，說明水提B部位能夠降低骨轉換，有升高去勢骨質疏松模型雌鼠血清E2的趨勢，但無差異性(P>0.05)。BGP是成骨細胞的特異性產(chǎn)物。壯骨止痛方水提B部位組血清BGP、PTH含量高于模型組，血清CT含量明顯降低，提示壯骨止痛方水提B部位能提高成骨細胞活性，促進骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述，壯骨止痛方水提B部位能顯著增加模型鼠骨密度，提高模型鼠骨生物力學性能，逆轉骨質疏松癥的病理形態(tài)學改變，有效治療骨質疏松癥。其機理可能是增強下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺皮質軸、胸腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素樣作用，促進骨髓細胞DNA合成和組織蛋白質合成，提高成骨細胞活性，促進骨形成;促進骨髓基質中的成骨細胞表達TGF-B1，并抑制 TNF-α的表達，間接抑制骨吸收。抑制骨髓細胞誘導破骨細胞的形成，從而減少破骨細胞的產(chǎn)生，通過下調(diào)這些骨調(diào)節(jié)相關細胞因子，抑制破骨細胞的形成，同時直接促進破骨細胞的凋亡。

[1]魏玉芳，王長海，劉鈺林，張姍紅，劉雅，李鋒，等.補腎法對大鼠絕經(jīng)后骨質疏松模型的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報，2007，28(6):544-545.

[2]葉純，蘇進，王凡，等.淫羊藿影響去勢大鼠椎骨微環(huán)境中TNF-α、TGF-β1 表達的研究[J].中國臨床解剖學雜志，2006，24(6):687-690.

[3]李晶晶，于世風，李鐵軍，等.淫羊藿對口腔各礦化組織破骨細胞性骨吸收的體外實驗研究[J].中華口腔醫(yī)學雜志，2002，37(5):391-394.

[4]葉純，蘇進，王凡，等.淫羊藿水提液對去勢大鼠松質骨的影響[J].中國臨床解剖學雜志，2008，26(1):87-90.