潘貴超，王輝奇，張治國(guó)

(1.北京昌平區(qū)華一醫(yī)院，北京 102208;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

隨著世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松骨折已成為臨床的常見病、多發(fā)病，合并嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人們的生存質(zhì)量。中藥治療骨質(zhì)疏松及骨折歷史悠久，療效確切，是目前治療骨質(zhì)疏松及骨折的主要手段之一。本研究擬從基因水平探討補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)骨折愈合的作用及其機(jī)理，為采用該方治療骨質(zhì)疏松骨折提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為清潔級(jí)8月齡健康Sprague Dawley(SD)雌性大鼠180只，體重250g～280g，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，在天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2005-0013。

1.1.2 主要藥物與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用中藥均由北京同仁堂公司提供，中藥方劑委托天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制成含生藥5g·ml-1的濃縮口服液，滅菌后裝瓶冷藏備用。陽(yáng)性對(duì)照藥采用貴州同濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn)的仙靈骨葆膠囊，批號(hào)20080607。青霉素由華北制藥廠生產(chǎn)，160萬(wàn)單位，批號(hào) 20080204。TGF-βmRNA ISH DIG KIT，復(fù)合消化液(T/P/E，Ph6.4)由天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司提供。DAB顯色試劑盒由福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)病理切片包埋機(jī)(EG1160)，德國(guó)萊卡;圖像分析軟件:ImagePro Plus 5.0。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 麻醉后，去勢(shì)組(OVX)進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)后12周，在腹腔麻醉下行大鼠股骨下端上2cm處切開手術(shù)刀切斷術(shù)，并行骨圓針逆行穿針術(shù)固定。

1.2.2 分組方法 用SPSS軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字的方法將140只大鼠隨機(jī)分為3組:正常組10只和骨質(zhì)疏松組(OVX)130只。3個(gè)月后處死正常組及骨質(zhì)疏松組各10只，測(cè)骨密度觀察模型復(fù)制情況。造模成功后再將骨質(zhì)疏松組120只大鼠分為陽(yáng)性對(duì)照組(仙靈骨葆膠囊)、模型組、補(bǔ)腎健脾活血組，每組40只，每組再隨機(jī)分為5個(gè)小組，每組8只大鼠。通過觀察補(bǔ)腎健脾活血組與模型組影響TGF-βmRNA表達(dá)情況來(lái)分析補(bǔ)腎健脾活血治療與模型組TGF-βmRNA表達(dá)不同。補(bǔ)腎健脾活血組與陽(yáng)性藥物組TGF-βmRNA表達(dá)陽(yáng)性比較補(bǔ)腎健脾活血治療與單純補(bǔ)腎治療促進(jìn)TGF-βmRNA表達(dá)不同。

1.2.3 給藥方法 補(bǔ)腎健脾活血中藥藥液按劑量5 g/(kg·d)灌胃，根據(jù)大鼠對(duì)人等效劑量的2倍每日早晚2次灌胃。陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予仙靈骨葆膠囊水溶液灌胃5 g/(kg·d)，空白對(duì)照組與模型組給予等量蒸餾水灌胃。所選用實(shí)驗(yàn)用方來(lái)源著名骨傷科專家劉柏齡教授經(jīng)驗(yàn)方:淫羊藿、熟地、鹿角霜、申姜、肉蓯蓉、敗龜板、生黃芪、鹿銜草、雞血藤、全當(dāng)歸、川杜仲、漢三七、廣陳皮、淮山藥、鹿角膠(烊化)、萊菔子。

1.2.4 標(biāo)本處理 術(shù)后第 7、14、28、42、56天每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)抽取8只大鼠用拉頸法處死，取出股骨置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40g·L－1的多聚甲醛(含1‰DEPC)4℃下固定24 h。取右側(cè)股骨標(biāo)本為研究對(duì)象，以骨折為中心取長(zhǎng)約10 mm的骨段，將其置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的 EDTA-Na2(含 1‰DEPC)脫鈣(每4 d更換1次脫鈣液)。待骨質(zhì)松軟，針刺及刀割無(wú)明顯阻力后表示脫鈣完成。

1.2.5 HE染色 根據(jù)HE染色有關(guān)試劑的使用說明及該病理科的操作技術(shù)規(guī)范進(jìn)行染色。

1.2.6 原位雜交 采用天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TGF-β(mRNA)ISH DIG KIT原位雜交試劑盒，對(duì)骨折標(biāo)本 TGF-βmRNA表達(dá)進(jìn)行原位雜交檢查。

1.2.7 圖像分析 以骨折中心在兩斷端附近相同位置對(duì)骨折端骨干細(xì)胞、骨外膜、骨內(nèi)膜、血腫、纖維骨痂、軟骨骨痂、骨小梁、小梁間組織及骨髓腔組織各取2個(gè)高倍鏡視野。用Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件，對(duì)這9種組織陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的平均光密度值(MOD)進(jìn)行分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠愈合過程組織形態(tài)學(xué)的影響

骨折后7d，斷端間為血腫及其機(jī)化后的纖維素，有單核細(xì)胞浸潤(rùn)。缺損區(qū)內(nèi)可見大量血腫細(xì)胞和炎性細(xì)胞。骨折后14d:所有標(biāo)本的外骨膜均增厚，部分標(biāo)本外骨膜增厚超過4層，少數(shù)標(biāo)本外骨膜成骨細(xì)胞顯著增生，增生細(xì)胞融合成一片，骨基質(zhì)沉著，形成類骨質(zhì)、軟骨及骨小梁;所有標(biāo)本骨內(nèi)膜增厚，大部分標(biāo)本骨髓腔內(nèi)有新生骨小梁生成，部分標(biāo)本新生骨小梁充滿骨髓腔。骨折后28d，絕大多數(shù)標(biāo)本骨折斷端成纖維細(xì)胞和纖維組織及類骨質(zhì)增多，所有標(biāo)本外骨膜成骨細(xì)胞顯著增生，增生細(xì)胞融合成一片，骨基質(zhì)沉著，形成骨樣組織、軟骨及骨小梁。骨折56d后，編織骨形成，骨髓腔內(nèi)的骨小梁變細(xì)，骨髓腔再通，編織骨逐漸向板層骨轉(zhuǎn)變。

2.2 補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠愈合過程中TGF-βmRNA表達(dá)的影響

術(shù)后7 d，補(bǔ)腎健脾活血組、陽(yáng)性對(duì)照組顯著高于模型組(P<0.01)，補(bǔ)腎健脾活血組與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異。術(shù)后14d，補(bǔ)腎健脾活血組與陽(yáng)性對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。術(shù)后28d，補(bǔ)腎健脾活血組與模型組有顯著差異(P<0.01)，補(bǔ)腎健脾活血組顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。術(shù)后42d，補(bǔ)腎健脾活血組與模型組有顯著差異(P<0.05)，其他各組無(wú)差別。術(shù)后56d，補(bǔ)腎健脾活血組、陽(yáng)性對(duì)照組顯著高于模型組(P<0.01)，補(bǔ)腎健脾活血組與陽(yáng)性對(duì)照組有顯著差異(P<0.05);各組總平均值:補(bǔ)腎健脾活血組極顯著高于模型組，陽(yáng)性對(duì)照組極顯著高于模型組(P<0.01)。

表 模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)腎健脾活血組骨折愈合過程中TGF-βmRNA表達(dá)MOD值變化

表 模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)腎健脾活血組骨折愈合過程中TGF-βmRNA表達(dá)MOD值變化

注:與模型組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較:＆P<0.05，＆＆P<0.01

天 數(shù) 模型組 陽(yáng)性對(duì)照組 補(bǔ)腎健脾活血組0.204±0.015 0.220±0.008＊＊ 0.225±0.011＊＊第 7天第14天 0.206±0.010 0.218±0.007* 0.233±0.009＊＊＆第28天 0.220±0.01 0.228±0.010 0.241±0.004＊＊＆第42天 0.219±0.010 0.229±0.008 0.229±0.006*第56天 0.203±0.009 0.225±0.007＊＊ 0.235±0.010＊＊＆平 均 值 0.210±0.013 0.224±0.009＊＊ 0.233±0.010＊＊＆＆

3 討論

中醫(yī)學(xué)無(wú)“骨質(zhì)疏松癥”這一病名，但歷代中醫(yī)文獻(xiàn)的記載中“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”的描述與OP的臨床癥狀頗似。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎虛是本病的主要病因，脾虛是本病的重要病機(jī)，肝血不足、氣滯血瘀是本病的促進(jìn)因素，所選用實(shí)驗(yàn)用方來(lái)源于著名骨傷科專家劉柏齡教授經(jīng)驗(yàn)方。補(bǔ)腎健脾活血法以“腎主骨”理論為指導(dǎo)，針對(duì)骨質(zhì)疏松癥“多虛多瘀”的病機(jī)特點(diǎn)，以申姜、肉蓯蓉補(bǔ)腎壯骨為主，輔之鹿角膠、淫羊藿、川杜仲補(bǔ)腎益精、強(qiáng)筋骨為臣，同時(shí)配以黃芪補(bǔ)中益氣，當(dāng)歸、雞血藤、三七活血止痛，廣陳皮、淮山藥、熟地、敗龜板滋陰益氣共為佐藥，此既培補(bǔ)后天生化之源以充腎精，又達(dá)到補(bǔ)中寓通、補(bǔ)而不滯的目的。本方具有補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)、健脾益氣滋陰的作用，組方上既強(qiáng)調(diào)補(bǔ)益又突出調(diào)節(jié)，補(bǔ)腎的同時(shí)注重祛瘀，體現(xiàn)出中醫(yī)學(xué)治療疾病的整體觀念和“標(biāo)本兼治”的思想。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，骨折愈合的實(shí)質(zhì)是骨細(xì)胞再生，骨折完全性修復(fù)，其整個(gè)過程受局部骨生長(zhǎng)因子的調(diào)控。大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究初步證實(shí)，骨折局部骨細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)于成骨的誘導(dǎo)、細(xì)胞的分裂增殖、細(xì)胞的分化成熟、骨基質(zhì)的合成與軟骨內(nèi)化骨及局部血液循環(huán)的重建等起著極其重要的作用，調(diào)控著骨折的再生修復(fù)過程。TGF-β可促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，刺激Ⅱ型膠原、骨連接素和骨橋蛋白的合成，同時(shí) TGF-β可抑制破骨細(xì)胞的生成以及成熟破骨細(xì)胞的活性，從而抑制骨吸收的作用，所以TGF-β在骨組織代謝過程中起著十分重要的作用[1～3]。

骨折后7 d，斷端間為血腫及其機(jī)化后的纖維素有單核細(xì)胞浸潤(rùn)，缺損區(qū)內(nèi)聚集大量血腫細(xì)胞和炎性細(xì)胞。骨折后14d，所有標(biāo)本的外骨膜均增厚，可見大量間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞與新形成的骨細(xì)胞。骨折后28d，絕大多數(shù)標(biāo)本骨折斷端成纖維細(xì)胞和纖維組織及類骨質(zhì)增多，所有標(biāo)本外骨膜成骨細(xì)胞顯著增生，增生細(xì)胞融合成一片，骨基質(zhì)沉著，形成骨樣組織、軟骨及骨小梁，在成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等表達(dá)陽(yáng)性。補(bǔ)腎健脾活血方主要促進(jìn)了大鼠骨折愈合過程中軟骨骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)化，提高了骨的強(qiáng)度，促進(jìn)了骨折愈合。

從骨折愈合整個(gè)時(shí)間點(diǎn)看，骨折后7d～56d，補(bǔ)腎健脾活血組極顯著高于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組極顯著高于模型組，說明從骨轉(zhuǎn)化和成纖維方面說明補(bǔ)腎健脾活血組能促進(jìn)斷端TGF-βmRNA表達(dá)的作用最強(qiáng)，顯著提高TGF-βmRNA表達(dá)峰值水平。通過與陽(yáng)性藥物組對(duì)比，說明根據(jù)骨質(zhì)疏松的病機(jī)辨證組方比單純補(bǔ)腎更能顯著提高TGF-βmRNA表達(dá)峰值水平，說明通過促進(jìn)斷端成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等 TGF-βmRNA表達(dá)可能是中藥促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的機(jī)制之一。補(bǔ)腎健脾活血方治療效果最好，說明辨證治療是必要的。

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