楊 娟，周向東

(重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010)

氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管擴(kuò)張癥等慢性炎癥性疾病的重要臨床病理特征，也已成為影響COPD病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。氧化應(yīng)激是啟動和加重炎癥反應(yīng)的重要因素，其主要物質(zhì)活性氧(ROS)已被證實(shí)是一種強(qiáng)化學(xué)介質(zhì)，能作用于細(xì)胞膜的受體激酶，調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并參與黏液高分泌過程[2]，但具體途徑尚未完全明了。表皮生長因子受體(EGFR)作為一種酪氨酸激酶受體，與氣道黏蛋白的表達(dá)有密切聯(lián)系[3]。有研究指出，過量的 ROS可上調(diào) EGFR的表達(dá)水平和增加其磷酸化水平，調(diào)控EGFR信號級聯(lián)及后續(xù)細(xì)胞分子效應(yīng)[4]。柚皮素是一種廣泛用于植物和中藥中的黃酮類化合物，國外研究證實(shí)，除具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤及降血脂的作用，還具有較強(qiáng)的抗氧化瘤及降血脂的作用，還具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。本研究旨在探討柚皮素對黏液高分泌的影響及其在ROS/EGFR細(xì)胞信號通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 柚皮素純度大于95%購于美國sigma公司，取其粉末溶解于20%的二甲基亞砜中，加不含血清的培養(yǎng)液稀釋為 400mmol/L，采用0.02μm微孔過濾器除菌、分裝，濾器除菌、分裝，避光－20℃冰箱保存，2個(gè)月內(nèi)有效，使用前以培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(100μmol/L)，二甲亞砜的終濃度<0.1%。

1.1.2 細(xì)胞來源 人肺上皮細(xì)胞株A549(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)培養(yǎng)于含10%小牛血清、雙抗(青霉素 100U/ml、鏈霉素 100U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃ 5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，每2d傳代1次并隨時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.1.3 主要試劑 人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(HNE)購自美國 EPC公司，Triton-X100為美國sigma公司，活性氧清除劑 DMTU購自美國Calbiochem公司，小鼠抗人黏蛋白(MUC)5AC單克隆抗體為美國Chemicon公司，兔抗EGFR多克隆抗體、小鼠抗磷酸化EGFR(P-EGFR)單克隆抗體為美國Cell Signaling公司，異硫氰酸(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠熒光素IgG、辣根酶標(biāo)記羊抗兔 IgG、辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒為大連寶生物工程有限公司，MUC5AC、EGFR、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由上海生物有限公司合成，活性氧試劑盒、免疫細(xì)胞沉淀裂解液為碧云天生物技術(shù)研究所，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞活性測定 將細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μl細(xì)胞懸液中含1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后換無血清培養(yǎng)液維持24h，分別加入濃度為0、20、50、80、100、200、400μmol/L 的柚皮素，作用24h后行甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定，酶標(biāo)讀數(shù)儀上以492nm波長測定各孔吸光度(A)值。不加柚皮素只加等量二甲基亞砜孔為陰性對照，無細(xì)胞僅加培養(yǎng)液孔為空白對照。各實(shí)驗(yàn)組安排6個(gè)復(fù)孔取平均值，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組值A(chǔ)值－空白對照組A值)/(陰性對照組 A值 －空白對照組 A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果基本一致，以其中1次實(shí)驗(yàn)值為準(zhǔn)，繪制細(xì)胞生存圖。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 細(xì)胞貼壁融合達(dá)70%～80%時(shí)傳代培養(yǎng)。用于RT-PCR檢測的細(xì)胞組接種于6孔板，每孔接種4×105個(gè)細(xì)胞，用于提取蛋白的接種于50ml培養(yǎng)瓶，每瓶接種20×105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合約為70%時(shí)更換無血清培養(yǎng)基(用0.1%牛血清白蛋白代替血清)繼續(xù)培養(yǎng)24h，以維持基礎(chǔ)濃度的黏蛋白表達(dá)。分組:(1)對照組:無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)處理組:無血清培養(yǎng)基中加入終濃度為50nmol/L的HNE;(3)柚皮素組:加入終濃度為100μmol/L的柚皮素，作用24h后再給予終濃度為50nmol/L的 HNE刺激;(4)DMTU組:先給予20μmol/L的DMTU處理，30min后，再給予終濃度為50nmol/L的HNE刺激;(5)柚皮素+DMTU組:先加柚皮素100μmol/L作用24h后，再給予20μmol/L的DMTU處理30min后，最后給予終濃度為50nmol/L的HNE刺激。各組處理24h內(nèi)取樣實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞中ROS含量的測定 處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基維持24 h，洗滌換液，分別加入終濃度5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L HNE和100μmol/L柚皮素?zé)o血清培養(yǎng)液孵育，對照組僅以無血清培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。24h后測定各組細(xì)胞中ROS的相對含量，按試劑盒操作說明進(jìn)行活性氧的測定，結(jié)果以吸光度A值表示。

1.2.4 RT-PCR檢測EGFR mRNA和MUC5AC mRNA的表達(dá)水平 分別提取各組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測定樣品A260/A280比值和濃度，確保比值介于1.8～2.0，總RNA提取后保存于－80℃冰箱，并于數(shù)日內(nèi)盡快使用。

兩步法進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增引物序列:EGFR上游引物5′-CTC-ACG-CAG-TTG-GGC-ACT-TT-3′，EGFR 下游引物:5′-TCA-TGG-GCA-GCT-CCT-TCAGT-3′，擴(kuò)增長度為 301bp;MUC5AC 上游引物:5′-TCA-ACG-GAG-ACT-GCG-AGT-ACA-C-3′，下 游 引物:5′-TCT-TGA-TGG-CCT-TGG-AGC-A-3′，擴(kuò)增長度為 135bp;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為 30℃、10min，42℃30min，95℃ 5min，5℃ 5min，以上步驟 1 個(gè)循環(huán)。MUC5AC+EGFR的PCR反應(yīng)條件為:于94℃預(yù)變性2min終止后，緊隨30個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù):94℃變性 30s，59℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1.5min，后 72℃延伸5min補(bǔ)齊末端。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，圖像采集后用Bandleader軟件進(jìn)行吸光度面積積分分析，以與GAPDH mRNA的比值作為目的基因mRNA的相對含量。

1.2.5 Western blot法檢測各目標(biāo)蛋白的表達(dá)

使用細(xì)胞裂解液冰上操作，提取各組培養(yǎng)瓶的總蛋白后加入5倍十二烷基硫酸鈉(SDS)，經(jīng)高溫加熱使蛋白完全變性、解聚，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鳂悠飞蠘恿繛?0μl，8%或12%SDS-PAGE凝膠恒壓電泳，濃縮膠80V，分離膠100V，給予聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，恒流250mA轉(zhuǎn)膜，EGFR和P-EGFR轉(zhuǎn)膜1h 50min，脫脂奶粉封閉 1h，加入一抗 4℃孵育過夜，一抗:1∶200的小鼠抗 P-EGFR單克隆抗體、兔抗EGFR多克隆抗體;PBST洗膜15min，加入二抗孵育1h，二抗1∶2000的辣根酶標(biāo)記羊抗兔 IgG，辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG。用增敏化學(xué)發(fā)光法顯影后，目標(biāo)條帶經(jīng)吸光度面積積分析，以與 β-肌動蛋白產(chǎn)物條帶的比值作為相對含量。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察不同條件下MUC5AC蛋白表達(dá)的變化 將對數(shù)生長期A549細(xì)胞消化后，接種于載有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，24h后更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后再分組培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后吸棄培養(yǎng)液，用0.01mmol/L的PBS漂洗，用4%多聚甲醛在室溫下固定30min，用0.4%Triton-X100在室溫下作用20min，加入羊血清工作液在室溫下封閉30min;去血清加入一抗(小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體1∶500)置濕盒內(nèi)4℃過夜，0.01mmol/L的 PBS漂洗;加二抗(FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG1∶100)，置濕盒內(nèi)室溫下 2h，0.01mmol/L的 PBS漂洗，滴加5mg/L碘化丙錠，室溫下5min 50%甘油封片;未加一抗僅加二抗者作為陰性對照，激光共聚焦顯微鏡觀察并成像。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞裂解液中MUC5AC蛋白含量 培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞在冰上用0.01mmol/L的PBS清洗，加入冰預(yù)冷的RIPA裂解液及相應(yīng)1/100量的苯甲基磺酰氟化物，晃動、吹打后吸入 EP管中冰浴 20min，4℃ 15000r/min離心20min，留上清液。取各樣本少許采用二喹啉甲酸法測定總蛋白含量，用RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度使各樣本一致，再用 PBS稀釋蛋白樣本。取各樣本100μl包被96孔酶標(biāo)板，置濕盒中4℃過夜。次日棄包被液，扣干后每孔加入200μl的1%牛血清白蛋白，于濕盒中37℃封閉1h。洗板后每孔加入1∶1000小鼠抗人 MUC5AC單克隆抗體 50μl，37℃孵育1h。洗板后扣干，四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶溶液顯色，終止反應(yīng)后測各孔在450nm處 A值，與標(biāo)準(zhǔn)品比較計(jì)算MUC5AC含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性測定結(jié)果

柚皮素濃度分別為 0、20、50、80、100、200 和400μmol/L時(shí)，細(xì)胞生存率分別為100% ±1.0%、98.2% ±0.2%、92.9% ±0.7%、84.6% ±0.3%和81.6% ±0.6%，表明柚皮素濃度低于 100μmol/L時(shí)對細(xì)胞無明顯損傷，隨著濃度遞增，當(dāng)柚皮素濃度達(dá)200μmol/L和400μmol/L時(shí)細(xì)胞貼壁能力降低，死亡細(xì)胞增多，細(xì)胞生存率分別為45.0% ±0.8%和25.4%±0.7%。

2.2 細(xì)胞中ROS的相對含量

在5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L的HNE刺激后的細(xì)胞中，ROS的相對含量分別為0.68±0.02、0.81±0.07和 0.98±0.08，說明隨著 HNE 濃度增加，ROS的含量逐漸增加，與對照組(0.39±0.06)比較，t值分別為 11.19、11.20和 11.43，50nmol/L的HNE和柚皮素預(yù)處理組(0.57±0.04)比較t值為11.23，均P<0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)意義，且表明柚皮素具有抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的作用。

2.3 各組指標(biāo)mRNA及蛋白的表達(dá)

表1顯示，MUC5AC、EGFRmRNA和 EGFR、PEGFR蛋白的表達(dá)吸光度面積積分值。

表1 各組指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)的吸光度面積積分值比較

表1 各組指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)的吸光度面積積分值比較

注:HNE:人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶;DMTU:活性氧清除劑;MUC5AC:黏蛋白5AC;EGFR:表皮生長因子受體?！訫UC5AC/總蛋白(μg/mg)表示。與對照組比較:＊＊P<0.01;與HNE組比較:△△P<0.01;與柚皮素組和DMTU組比較:##P<0.05

組 別n mRNA蛋白MUC5AC EGFR MUC5AC▲EGFR P-EGFR對照組 3 0.70±0.02 0.73±0.01 112±4 0.39±0.03 0.38±0.02 HNE 3 0.92 ±0.08＊＊ 0.91 ±0.05＊＊ 152 ±6＊＊ 0.86 ±0.03＊＊ 0.93 ±0.05＊＊柚皮素 3 0.57±0.09△△ 0.54±0.07△△ 125±6△△ 0.52±0.05△△ 0.61±0.01△△DMTU 3 0.62±0.06△△ 0.63±0.03△△ 128±4△△ 0.53±0.02△△ 0.74±0.05△△柚皮素 +DMTU 3 0.34±0.04## 0.38±0.03## 113±2## 0.42±0.02## 0.41±0.03##

表1顯示，與對照組相比，給予 HNE刺激后MUC5AC mRNA、EGFR mRNA 和 EGFR、P-EGFR 蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，而給予柚皮素和 DMTU預(yù)處理后表達(dá)減弱，柚皮素組與 HNE組比較 P<0.01;DMTU組與 HNE組比較 P<0.01;柚皮素 +DMTU組分別與柚皮素組和DMTU組比較，以上指標(biāo)表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。

2.4 HNE刺激前后和柚皮素預(yù)處理后A549細(xì)胞MUC5AC的激光共聚焦顯像

經(jīng)異硫氰酸熒光素/碘化丙錠染色的高倍放大鏡結(jié)果顯示，圖A中未加一抗的陰性對照組A549細(xì)胞僅可見呈紅色顯色少量的 MUC5AC;圖 B中A549細(xì)胞的MUC5AC蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈綠色顯色;圖 C中 A549細(xì)胞經(jīng) HNE處理后MUC5AC的表達(dá)較 A549細(xì)胞明顯增多;圖 D中經(jīng)柚皮素處理后A549細(xì)胞在胞質(zhì)的表達(dá)減少。

圖1 A549細(xì)胞黏蛋白表達(dá)(激光共聚焦顯微鏡×400)

3 討論

黏液高分泌是影響慢性氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要因素。目前認(rèn)為，HNE除了是參與急性肺損傷的主要因素外，還是黏蛋白表達(dá)的最強(qiáng)誘導(dǎo)物，也是炎癥反應(yīng)時(shí)氣道黏液高分泌形成過程的主要刺激因子，而MUC5AC則為炎癥反應(yīng)氣道黏蛋白的主要特征性表型，并決定著高分泌黏液的病理特征[5]。

EGFR通過配體依賴和非配體依賴機(jī)制而自身磷酸化，引發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)，并傳遞至細(xì)胞核而活化相應(yīng)的順式反應(yīng)元件，啟動黏蛋白合成。有研究表明，多種刺激因子均可借配體依賴途徑激活EGFR信號級聯(lián)通路引起黏蛋白合成增加[6]。氣道炎癥時(shí)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞大量聚集，可釋放HNE并刺激局部釋放多量ROS。以往的研究提示，ROS可通過激活 EGFR的配體釋放而間接激活 EGFR[7];而最近的研究也表明，ROS還可通過非配體依賴機(jī)制直接反相激活EGFR。通過減少EGFR表達(dá)和活化的刺激來抑制黏液高分泌，可能是治療氣道黏液高分泌的有效靶點(diǎn)，而ROS由于兼具雙重刺激機(jī)制成為重要靶目標(biāo)。

柚皮素是柚油的主要成分，主要來源于未成熟的柚子皮，具有抑制氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生和增強(qiáng)抗氧化物酶活性的作用[8]。本研究首先以 HNE為刺激因素，檢驗(yàn)其是否可誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞A549產(chǎn)生大量的ROS，引起EGFR磷酸化水平增高，上調(diào)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，A549細(xì)胞經(jīng)HNE處理后，細(xì)胞內(nèi) ROS含量增加，其 MUC5AC mRNA及MUC5AC蛋白含量也增加，且EGFR和PEGFR也明顯增加，說明黏蛋白的增加與 EGFR的活化呈正相關(guān)，這與MUC5AC合成受EGFR信號通路調(diào)控的研究結(jié)果一致。當(dāng)給予柚皮素干預(yù)后，通過活性氧試劑盒測定人 A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，RT-PCR測定 EGFR mRNA和 MUC5AC mRNA均較HNE刺激組明顯下調(diào)。Western blot法檢測結(jié)果表明，相應(yīng)的EGFR和P-EGFR蛋白表達(dá)明顯降低;細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果也表明，經(jīng)柚皮素預(yù)處理后MUC5AC蛋白表達(dá)減少;激光共聚焦觀察結(jié)果也顯示，柚皮素處理后A549細(xì)胞質(zhì)中 MUC5AC蛋白表達(dá)減弱，提示柚皮素可抑制 ROS的產(chǎn)生而引起EGFR的表達(dá)下調(diào)及其磷酸化水平降低來減少黏蛋白的轉(zhuǎn)錄和合成。此外還觀察到，柚皮素+DMTU組EGFR mRNA和其蛋白以及MUC5AC的表達(dá)比單用DMTU組要低，提示柚皮素可通過直接降低EGFR膜受體水平和阻斷EGFR磷酸化來進(jìn)一步降低黏蛋白的轉(zhuǎn)錄和合成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，柚皮素對黏液高分泌的主要發(fā)生途徑有明顯的抑制作用，這為柚皮素的藥用開發(fā)提供了理論依據(jù)。

綜上所述，柚皮素可明顯改善炎性刺激所致的氣道黏液高分泌狀態(tài)，其機(jī)制主要系通過抑制ROS的產(chǎn)生、降低EGFR膜受體水平和阻斷EGFR磷酸化來實(shí)現(xiàn)的。柚皮素這一效應(yīng)，顯示了對肺部炎性疾病發(fā)生、發(fā)展的有益作用，加之其資源豐富、成本低廉，具有一定的開發(fā)價(jià)值。

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