王振濤，韓麗華，楊鳳鳴，惠 玲

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450011;2.南陽(yáng)市中醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473007)

擴(kuò)張型心肌病的心室重構(gòu)是該病發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)。心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc，ECM)的變化是心室重構(gòu)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。心肌細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)刻處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的合成－降解過程中，一旦動(dòng)態(tài)平衡被打破，膠原網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重建，必將導(dǎo)致心室重構(gòu)[1]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetallo-Proteinases，MMP)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissueinhibitorsofmetal-loproteinase，TIMP)的調(diào)節(jié)對(duì)心肌細(xì)胞外基質(zhì)起重要的作用[2]。本研究觀察抗纖益心方對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌ECM的影響，并通過觀察擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3，MMP-3)及其抑制因子-3(Tissueinhibitorsof metalloproteinase-3，TIMP-3)表達(dá)水平的變化并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 用藥

抗纖益心方干浸膏由黨參、黃芪、云苓、白術(shù)、丹參、川芎、紅花、赤芍、澤蘭、益母草組成，由河南省中醫(yī)院制劑室提供，每克干浸膏相當(dāng)于生藥4g;呋喃唑酮片由福建省三明天泰制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20050204;卡托普利片由常州制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)200502242;戊巴比妥鈉為中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號(hào)F20021216。

1.1.2 試劑

MMP-3多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0413R;TIMP-3多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0417R;兔兩步法二抗:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV-6001;DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9032。

1.1.3 器材 JY-1001型精密電子天平(上海民橋電子儀器廠);石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司，型號(hào)SM-2000R);光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS公司);攝影顯微鏡(德國(guó)萊卡公司);Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像處理分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.2 動(dòng)物造模及分組

選取體重為 61.9g±7.0g的 Wistar雄性大鼠(鄭州大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)510116。把動(dòng)物按5∶1隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組。參照文獻(xiàn)方法[3]，模型組在飲水中加呋喃唑酮(按1kg水加700mg呋喃唑酮配置)喂養(yǎng)8周。正常組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.3 治療方法

造模8周后開始藥物干預(yù)，每天1次給藥。模型組動(dòng)物每日管飼與治療組同等容積的生理鹽水;抗纖益心方小劑量組(中藥小劑量組)動(dòng)物每日管飼抗纖益心方4.7g/(kg·d);抗纖益心方大劑量組(中藥大劑量組)動(dòng)物每日管飼抗纖益心方18.8g/(kg·d);卡托普利對(duì)照組動(dòng)物每日管飼卡托普利10.125mg/(kg·d);卡托普利與抗纖益心方大劑量合用組(中西藥聯(lián)用組)動(dòng)物同時(shí)管飼卡托普利及抗纖益心方大劑量。灌藥同時(shí)所有擴(kuò)張型心肌病造模大鼠同時(shí)繼續(xù)飲用呋喃唑酮水溶液。藥物干預(yù)8周后處死動(dòng)物。正常組動(dòng)物每日管飼與治療組同等容積的生理鹽水。

1.4 心肌取材

藥物干預(yù)8周后麻醉動(dòng)物，迅速打開胸腔取出心臟，濾紙吸干水分，剪去左、右心房及右心室，然后從心尖處沿冠狀面切取左心室心肌組織，放入10%中性緩沖福爾馬林液中固定，石蠟包埋，制備厚4μm組織切片。

1.5 免疫組化染色方法

MMP-3、TIMP-3陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)均采用免疫組化法。二甲苯脫蠟(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)各15min，降濃度梯度100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇脫二甲苯各5min，水洗2min，蒸餾水沖洗2min×3次，PBS漂洗2min×3次，微波抗原修復(fù)，高火加熱至枸櫞酸緩沖液沸騰后改低火加熱15min，自然冷卻后PBS漂洗2min×3次，滴加50ul 3%H2O2，孵育10min，滅活組織內(nèi)源性抗原，PBS漂洗2min×3次，滴加50ul MMP-3或TIMP-3抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜，次日濕盒恢復(fù)至室溫，PBS漂洗2min×3次，滴加 50ul二抗 PV-6001，37℃ 孵育30min，PBS 漂洗2min×3次，DAB顯色8min，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，乙醇升梯度70%、80%、90%、95%、100%，脫水各 5min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)透明各 15min，中性樹膠封片。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)方法

MMP-3、TIMP-3平均光密度值(OD)的測(cè)定:光鏡下，每只大鼠觀察6張切片，每張切片在圖像分析系統(tǒng)上隨機(jī)選取相等的5個(gè)高倍視野(×400)測(cè)定OD值，每張片子測(cè)量后取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

圖1、2顯示，光鏡下各組 MMP-3和 TIMP-3的陽(yáng)性染色呈棕黃色或棕褐色，陽(yáng)性區(qū)域主要分布于心肌間質(zhì)。

圖1 左室心肌組織MMP-3免疫組化染色照片(×400)

圖2 左室心肌組織TIMP-3免疫組化染色照片(×400)

2.1 各組MMP-3比較

與模型組比較，中藥大劑量組、中藥小劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)用組 MMP-3陽(yáng)性表達(dá)減少(P<0.05)，其中以中西藥聯(lián)用組作用最強(qiáng)。

2.2 各組TIMP-3比較

與模型組比較，中藥大劑量組、中藥小劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)用組TIMP-3陽(yáng)性表達(dá)增加(P<0.05)，其中仍以中西藥聯(lián)用組作用最強(qiáng)。

3 討論

心室重構(gòu)是擴(kuò)張型心肌病發(fā)生、發(fā)展的基本病理環(huán)節(jié)，而ECM重構(gòu)(間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生及其合成的心肌膠原含量的增加)是心室重構(gòu)的重要組成部分。心肌細(xì)胞間質(zhì)時(shí)刻處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的合成-降解過程中，一旦動(dòng)態(tài)平衡被打破，膠原網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重建，必將導(dǎo)致心室重構(gòu)[1]。

MMPS的異常參與了許多心血管疾病的發(fā)病過程，MMPS的表達(dá)和活性過度增強(qiáng)或 MMPS/TIMPS比例失調(diào)導(dǎo)致正常的心肌膠原蛋白過度降解，并被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維性間質(zhì)取代，使心肌膠原重構(gòu)，引起心腔擴(kuò)大、室壁變薄導(dǎo)致心功能惡化[4]。MMP-3是MMPS中的1種，除了能降解膠原，還能降解基底膜成分，廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，其獨(dú)特的功能是能夠激活其他種類的 MMPS[5]，從而啟動(dòng)膠原增殖反應(yīng)。TIMP-3是TIMPs家族中的重要成員，具有與其他TIMPs成員不同的特性，它只存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，是一種結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)的非可溶性蛋白[6]。DCM心肌中存在 MMP/TIMP的平衡及活性受到破壞，必然導(dǎo)致基質(zhì)膠原代謝紊亂，心肌細(xì)胞外膠原積聚，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)[7]。

表各組MMP-3、TIMP-3 OD值結(jié)果比較

表各組MMP-3、TIMP-3 OD值結(jié)果比較

注:與正常組比較:*P<0.05;與模型組比較:△P<0.05

別 n MMP-3 OD值 TIMP-3 OD 值 常 組 6 0.1670±0.0107△ 0.9052±0.068 型 組 6 0.2480±0.0116* 0.5183±0.036組正6△模9*卡托普利組 6 0.1812±0.0106△ 0.7540±0.0409＊△中藥大劑量組 5 0.1758±0.0075＊△ 0.7482±0.0386＊△中藥小劑量組 6 0.2067±0.0100＊△ 0.6137±0.0624＊△中西藥聯(lián)用組 6 0.1751±0.0122△ 0.8581±0.0537△

本研究測(cè)定實(shí)驗(yàn)性擴(kuò)張型心肌病大鼠MMP-3及TIMP-3陽(yáng)性表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方大劑量有同對(duì)照西藥卡托普利相同的降低MMP-3和升高TIMP-3的作用，且抗纖益心方大劑量與卡托普利合用組作用更明顯，表明兩藥合用可能對(duì)抑制心肌纖維化有協(xié)同作用。而小劑量抗纖益心方對(duì)擴(kuò)張型心肌病大鼠MMP-3和TIMP-3的作用與大劑量抗纖益心方的作用比較也有差異，表明抗纖益心方抑制擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌纖維化的作用隨其劑量的增加而增強(qiáng)。

[1]Spinale FG，Coker ML，Bond BR，et al.Myocardial matrix degradation and metaloproteinase activation in the failing heart:a potential therapeutic target[J].Cardiovasc Res，2000，46(2):225-238.

[2]王麗萍，楊方.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與心肌纖維化[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2005，4(13):517-519.

[3]黃榮杰，劉唐威，伍偉鋒，等.呋喃唑酮制備大鼠擴(kuò)張型心肌病模型[J].中國(guó)病理生理雜志，2003，23(10):2147-2150.

[4]覃遠(yuǎn)漢，劉唐威，伍偉鋒，等.MMP-3、TIMP-1在病毒性心肌炎中的表達(dá)及其與心肌膠原的關(guān)系[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22(2):182-185.

[5]Thomas CV，Coker ML，Zellner JL，et al.Increased matrix metalloproteinase activity and selective up regulation in LV myocardium from patients with end-stage dilated car diomyopathy[J].Circulation，1998，97(17):1708-1715.

[6]呂國(guó)麗，文劍明.金屬蛋白酶組織抑制因子-3的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控和生物學(xué)功能[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2003，2(1):53-56.

[7]WoodiwissAJ，TsotetsiOJ，SprottS，etal.Reduction in myocardial collagen crosslinking parallels left ventricular dilation in rat models of systolic chamber dysfunction[J].Circulation，2001，103:155-160.