陳君義 孫慧宇 舒永蘭 王云飛

(1.張家港出入境檢驗檢疫局,張家港 215600； 2.徐州出入境檢驗檢疫局,徐州 221006)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)屬廣譜抗生素，曾作為動物臨床常用的抗生素用于預防和治療動物因細菌、立克氏體引起的炎癥和疾病。但由于氯霉素具有抑制造血機能等毒副作用，還可引起不同的個體反應，如肝損傷、視神經(jīng)炎、白血病等，因此目前許多國家嚴格禁止將氯霉素用于食用動物，規(guī)定其最高殘留限量為0～0. 01 mg/kg。隨著科學技術的進步，國外對進口動物源性產(chǎn)品中氯霉素的檢出限量不斷降低，歐盟的最低執(zhí)行限量值為0.3 μg/kg[1]。有的國家甚至禁止對中國的某些動物源產(chǎn)品的進口，這對我國的出口貿(mào)易造成了嚴重影響，因此動物源性產(chǎn)品中氯霉素的殘留檢測變得尤為重要。

目前有關氯霉素在食品中的殘留量分析方法主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)法[2]、氣相色譜(GC)法[3]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)法[4]、液相色譜(HPLC)法[5]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[6-10]等。ELISA 法主要用于快速篩選檢測，但定性和定量均不夠準確；GC和GC/MS存在檢出限難以達到要求、背景干擾較大或樣品凈化不完全以及衍生化難等問題；HPLC分析較準確且過程相對較簡便，因而應用較多，但隨著LC-MS/MS技術發(fā)展的日趨成熟，該方法被越來越多地應用于測定和確證動物源產(chǎn)品中氯霉素的痕量殘留。以待測物的同位素標記物作為內(nèi)標，補償前處理過程和定量過程中的偏差，可以解決LC分析過程中的基質(zhì)效應和處理過程中提取效率的問題[11]。

筆者在動物源性樣品中加入氘代氯霉素作為內(nèi)標，經(jīng)乙酸乙酯提取、正己烷去脂后，無需過凈化小柱，直接用LC-MS/MS測定動物源性產(chǎn)品中氯霉素殘留量。該法操作簡便，分析時間短，定性和定量的準確性高，滿足進出口食品的獸藥殘留監(jiān)控要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)：API4000型，美國AB公司；

甲醇：HPLC級；

乙酸乙酯、正己烷：優(yōu)級純，國藥集團；

氯霉素標準品(CAP)：純度為98.5%，德國Dr. E公司；

氯霉素-d5標準品(CAP-d5)：純度為98.6%，德國Witega公司；用色譜級甲醇配制成1 000 μg/L的標準儲備液，貯存在4℃冰箱中，實驗中根據(jù)需要用甲醇稀釋至適當濃度的標準工作液。

實驗用水為去離子水。

1.2 樣品制備

在龍蝦樣品中取出有代表性的樣品約500 g，取可食部分用粉碎機絞碎；從所取腸衣樣品中取出有代表性樣品約300 g，用剪刀剪碎(小于0.5 cm)。將粉碎的樣品混合均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為待測樣，密封,在-18℃條件下保存。

1.3 樣品前處理

(1)龍蝦：稱取5 g樣品(精確到0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，準確加入200 μL氯霉素-d5內(nèi)標溶液(10 ng/mL)，加入20 mL乙酸乙酯，高速均質(zhì)2 min，超聲10 min，然后以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，于45℃下旋轉蒸發(fā)至近干，然后依次加入4 mL正己烷和5.0 mL水溶解，并轉移至10 mL試管中。振蕩1 min后離心，棄去有機相，取1 mL水相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機測定。

(2)腸衣：稱取5 g樣品(精確到0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，準確加入200 μL氯霉素-d5內(nèi)標溶液(10 ng/mL)，加入20 mL乙酸乙酯，于渦旋混合器上混勻1 min，超聲波超聲20 min，然后以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，并按上述方法操作。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：25 μL；流動相：A相為甲醇，B相為水。

梯度洗脫程序：0～2 min，A相保持30%；2.0～3.5 min，A相從30%線性升至90%，保持3.5 min；0.1 min內(nèi)，A相降至30%，保持至4 min。

電噴霧離子源，負離子掃描模式(ESI-)，多反應監(jiān)測(MRM)；離子源噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：550℃。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

目前在檢測食品中氯霉素殘留時通常采用乙酸乙酯提取，用正己烷去脂，然后再用乙酸乙酯反萃取等前處理方法。由于樣品很難在均質(zhì)器中達到完全破碎，尤其是腸衣，故在試驗中，通過超聲的方法改善提取效果，加入同位素內(nèi)標，補償提取偏差，免去小柱凈化步驟，縮短了前處理時間，減少了有機試劑消耗量且有效保證了分析結果的穩(wěn)定性和準確性。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氯霉素分子式為C11H12O5N2Cl2，分子量為322，其同位素內(nèi)標(5個不同位置上的氫被氘取代)的分子量為327，兩者的理化性質(zhì)接近，使用同位素可以矯正在樣品提取過程中氯霉素的損失，提高測定方法的回收率。

將氯霉素標準品在負離子模式下進行質(zhì)譜全掃描，其母離子為m/z320.8，主要子離子碎片有m/z151.8、 175.8、193.7、256.8(見圖1)。根據(jù)豐度大小選擇定性和定量離子對，見表1。

圖1 氯霉素全掃描圖

2.3 標準工作曲線

在標準系列溶液中加入40 μL(與樣品中同位素內(nèi)標體積比例相同)的同位素混合內(nèi)標，按上述實驗步驟操作，以峰面積比X(標準峰面積與內(nèi)標峰面積之比)為橫坐標，氯霉素濃度c(ng/mL)為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為c= 0.245 7X-0.001 3，r2=0.999 4，標準工作曲線線性范圍為0.05～2.0 ng/mL。

2.4 樣品中氯霉素含量的計算

樣品處理后經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測后，按照公式(1)計算樣品中氯霉素的含量：

(1)

其中：X——樣品中氯霉素的含量，μg/kg；

c——最終提取物中濃度，ng/mL；

V——最終定容體積，mL；

M——稱樣量，g。

按此方法檢測，樣品中氯霉素的檢出限為0.05 μg/kg。

2.5 加標回收率和精密度試驗

以不含有氯霉素殘留的龍蝦和豬腸衣為樣品，按照1.3方法進行提取、凈化和測定，在0.1、0.2、0.3 μg/kg 3個濃度水平上進行加標回收試驗，氯霉素在兩種樣品中的添加回收率范圍為71.8%～90.0%，相對標準偏差均小于3%，試驗結果見表2。

表2 龍蝦和腸衣樣品中不同添加水平的回收率(n=5)

2.6 方法適用性

使用該方法對動物源性食品龍蝦、銀魚、蜆肉、羊腸衣、豬腸衣、蝦仁等進行檢測，檢測回收率穩(wěn)定。

3 結論

采用氯霉素的同位素標記作為內(nèi)標，補償了處理過程和液質(zhì)聯(lián)用中產(chǎn)生的誤差，有效地提高了定量的靈敏度，保證了實驗的回收率；同時采用同位素內(nèi)標，以雙離子監(jiān)控的模式，可以準確地甄別樣品中氯霉素的存在，保證了檢測結果的準確性，滿足國內(nèi)外對該類化合物在進出口食品中的監(jiān)控要求。提取過程無需使用凈化小柱，檢測成本低，操作簡便，分析時間短，實現(xiàn)了動物源性食品中對氯霉素的快速、經(jīng)濟檢測。

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