(1.齊齊哈爾大學(xué)，齊齊哈爾 161006； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013)

硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)分解迅速，其原位穩(wěn)定性只有數(shù)小時(shí)，而其大部分代謝產(chǎn)物能與蛋白質(zhì)結(jié)合，在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定幾個(gè)星期之久。又因食用含有硝基呋喃類藥物代謝產(chǎn)物的動(dòng)物性食品對(duì)人體有致癌性和誘導(dǎo)基因突變，給人體健康造成很大的危害[1-3]，所以歐盟、美國、日本明文規(guī)定禁止將其用于所有食品動(dòng)物的一類獸藥，并將其列入必檢名單。我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類藥物的禁令。呋喃它酮是硝基呋喃類藥物中最具代表性、最常用的一種。作為呋喃它酮的代謝產(chǎn)物，5-甲基嗎啡-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)是重要的檢測目標(biāo)物，但是目前國內(nèi)外沒有AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，所以AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制顯得非常迫切。AMOZ的分子式為C8H15N3O3，分子量為201.2，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 AMOZ結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：C-20AT型，日本島津公司；

氣相色譜儀：6890N型，美國Agilent公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Nicolet iS10型，美國Thermo公司；

液相色譜-質(zhì)譜儀: 6410型，美國Agilent公司；

卡爾費(fèi)休水分滴定儀：DL39型，瑞士Merrler Toledo公司；

熱重分析儀(TGA)：Pyris 1 TGA型，美國PE公司；

差示掃描量熱儀: PE Diamond型，美國PE公司；

乙腈：色譜純，美國Merck公司；

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

乙酸銨：分析純，美國Sigma公司；

AMOZ樣品：市售,經(jīng)分離提純制得；

實(shí)驗(yàn)室用水為Millipore高純?nèi)嗡?/p>

1.2 定性分析

將液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和紅外光譜法用于主成分定性確認(rèn)。將固體純品配成10 μg/mL的乙腈溶液，采用流動(dòng)注射的方式進(jìn)行液相色譜-電噴霧離子化-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析。將固體純品與溴化鉀混合研磨均勻，在紅外光譜儀上進(jìn)行分析。

1.3 定量分析

(1)液相色譜條件

色譜柱：TSK-GEL Amide-80 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈-20 mmol 乙酸銨(體積比95∶5)，流速為1.0 mL/min；樣品濃度：1.0 mg/mL(溶劑為乙腈)；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測波長：210 nm。

(2)氣相色譜條件

色譜柱: DB-1 (30 m×0.32 mm，1.0 μm)；升溫程序：初始溫度50℃，以5℃/min升至100℃，保持1 min，以15℃/min升至250℃，保持9 min；進(jìn)樣口溫度：280℃；FID檢測器溫度：250℃；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：20∶1；分析時(shí)間：30 min。

(3)差示掃描量熱法條件

使用固體坩堝測試；升溫程序：初始溫度105℃，保持1 min，以1℃/min升至125℃； Ro固：30.5℃/W；積分區(qū)間：114～121.5℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

圖2 AMOZ樣品液相色譜-質(zhì)譜圖

圖3 AMOZ樣品的紅外光譜圖

2.2 液相色譜定量方法建立

文獻(xiàn)[4-6]中關(guān)于AMOZ的檢測方法多為衍生后采用液相色譜-質(zhì)譜法測定，高效液相色譜法較少，為了確定最優(yōu)的高效液相色譜定量分析條件，分別對(duì)分離模式、流動(dòng)相、檢測波長、緩沖鹽種類、樣品溶劑、檢測器種類及檢測線性進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化。

(1)分離模式的選擇

采用不同類型的色譜柱，比較了5種不同分離模式對(duì)目標(biāo)物的分析，包括ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱反相洗脫模式、BioBasic SCX (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱離子交換洗脫模式、Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱離子對(duì)色譜模式、親水正相柱Waters Atlantics Hilic (150 mm×4.6 mm，5 μm)和氨基柱TSK-GEL Amide-80 (250 mm×4.6 mm，5 μm)進(jìn)行親水作用色譜模式。結(jié)果表明：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，20 min內(nèi)5%乙腈到95%乙腈梯度洗脫時(shí)AMOZ無保留，應(yīng)該是分析物極性太強(qiáng)的緣故；當(dāng)用乙腈+乙酸胺(95+5)作流動(dòng)相時(shí)，BioBasic SCX 色譜柱上AMOZ保留時(shí)間為4.2 min，但雜質(zhì)鋒與主峰分離不理想；10 mmol辛烷磺酸鈉+乙腈(95+5)流動(dòng)相條件下，AMOZ保留時(shí)間為4.0 min，但是能夠檢測的雜質(zhì)峰只有1個(gè)，是由于離子對(duì)試劑導(dǎo)致檢測靈敏度降低的緣故；當(dāng)用乙腈與20 mmol乙酸銨緩沖液(80+20)作流動(dòng)相時(shí)，AMOZ 在Atlantics Hilic色譜柱上的保留時(shí)間為6.4 min，但是色譜峰拖尾嚴(yán)重； 采用TSK-GEL Amide-80色譜柱時(shí)保留、峰形和分離情況均比較理想，因此實(shí)驗(yàn)選擇該色譜柱。

(2)樣品溶劑與流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇、乙腈和水作為樣品溶劑對(duì)分析的影響，結(jié)果表明：甲醇和乙腈均是AMOZ的良溶劑，均具有較好峰形與保留，而水溶的AMOZ的色譜峰明顯變寬，峰形不對(duì)稱。

采用TSK-GEL Amide-80色譜柱，比較了4種流動(dòng)相條件下的分離情況，包括乙腈+20 mmol乙酸銨緩沖液(95+5)；乙腈+20 mmol乙酸銨緩沖液(98+2)；乙腈+水(95+5)；梯度洗脫(乙腈濃度于5 min內(nèi)由99%降至90%，并以90%的濃度保持7 min，然后于3 min內(nèi)濃度增至99%，并以99%的濃度保持5 min)。圖4是不同流動(dòng)相AMOZ樣品色譜圖，結(jié)果表明：乙腈+20mmol乙酸銨緩沖液(95+5)流動(dòng)相條件下，保留時(shí)間為8.3 min，且能與相關(guān)雜質(zhì)很好地分離。

1—乙腈+20 mmol乙酸銨緩沖液(95+5)；2—乙腈+20 mmol乙酸銨緩沖液(98+2)；3—乙腈+水(95+5)； 4—梯度洗脫

圖4 不同流動(dòng)相AMOZ樣品色譜圖

(3)檢測模式與波長選擇

比較了紫外檢測器和電噴霧檢測器，發(fā)現(xiàn)AMOZ在電噴霧檢測器與紫外檢測器上均有較強(qiáng)的響應(yīng)，但是電噴霧檢測器對(duì)樣品中雜質(zhì)的響應(yīng)極弱，幾乎看不到其它雜質(zhì)峰，所以選擇紫外檢測器作為定量分析的檢測器。

AMOZ及其雜質(zhì)的紫外吸收波長范圍為195～230 nm，波長大于230 nm時(shí)沒有吸收，因此考察了195、200、210、220 nm 4個(gè)波長下樣品中主成分與雜質(zhì)的響應(yīng)差異。結(jié)果表明：在不同檢測波長下，色譜峰數(shù)量和峰面積大小有一定差異，但是在210 nm波長下，檢測出的色譜峰數(shù)量最多，且基線也較平。因此選擇210 nm為AMOZ的檢測波長，不同波長響應(yīng)的差異在不確定度評(píng)定中綜合考慮。

(4)檢測器線性考察

樣品濃度為1.0 mg/mL，進(jìn)樣量1～40 μL范圍內(nèi)，以色譜圖(210 nm)中所有峰面積的總和為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制校正曲線。結(jié)果表明：AMOZ及其樣品中的雜質(zhì)在該范圍內(nèi)線性良好，因此在此范圍內(nèi)進(jìn)行定值定量分析。

綜上所述，在確定的最優(yōu)液相色譜分析條件下，采用面積歸一化法對(duì)AMOZ進(jìn)行定量分析，AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC-DAD色譜圖見圖5。

圖5 AMOZ樣品液相色譜圖

2.3 氣相色譜定量方法與優(yōu)化

采用氣相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，對(duì)色譜柱、進(jìn)樣口溫度、升溫程序、檢測器種類分別進(jìn)行優(yōu)化。比較了DB-1和DB-200兩種色譜柱對(duì)AMOZ樣品分離的情況。結(jié)果表明：DB-200色譜柱不能將雜質(zhì)與主成分分離，DB-1色譜柱能較好分離雜質(zhì)和主成分，主成分的保留時(shí)間適中(22.3 min)，因此氣相定量分析選擇DB-1色譜柱?？疾炝瞬煌纳郎爻绦?，最后確定最優(yōu)程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，以5℃/min升至100℃，保持1 min，以15℃/min升至250℃，保持9 min。在該條件下一共分離出3個(gè)雜質(zhì)，雜質(zhì)峰與主峰完全分離。由于AMOZ同時(shí)含有碳原子和氮原子，氫火焰離子化檢測器與氮磷檢測器都可以檢測主成分，所以有必要對(duì)兩種檢測器進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氮磷檢測器檢測不出雜質(zhì)峰，可能是由于氮磷檢測器是專屬性檢測器，某些雜質(zhì)峰含N量很少或不含N，沒有響應(yīng)，所以相比之下氫火焰離子化檢測器更適用于主成分和雜質(zhì)的分析。為避免樣品在進(jìn)樣口分解或不能完全氣化，考察了進(jìn)樣口150～300℃溫度范圍。結(jié)果表明：在此范圍內(nèi)AMOZ的純度沒有明顯變化。說明進(jìn)樣口溫度在此范圍內(nèi)，樣品可完全氣化且不分解。

在確定的最優(yōu)氣相色譜分析條件下，采用面積歸一化法對(duì)AMOZ進(jìn)行定量分析，AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的GC-FID色譜圖見圖6。

圖6 AMOZ樣品氣相色譜圖

2.4 均勻性檢驗(yàn)

對(duì)研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行瓶間和瓶內(nèi)均勻性試驗(yàn)，隨機(jī)抽取15瓶，進(jìn)行瓶間均勻性考察，從15瓶中任意抽取一瓶，平行做7個(gè)子樣，采用氣相色譜法進(jìn)行瓶內(nèi)均勻性的考察，將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 采用氣相色譜檢測AMOZ樣品的均勻性試驗(yàn)結(jié)果

查表得，F(xiàn)0.05(14,6)=3.96，tα=2.09，F(xiàn)≤F0.05(14,6)，t≤tα，證明研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)瓶間和瓶內(nèi)樣品均勻一致，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制均勻性的要求。

2.5 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值隨時(shí)間變化的度量,該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的考察,按先密后疏的原則,對(duì)避光冷藏保存的樣品定期抽樣,用氣相色譜法檢測其純度,檢測結(jié)果列于表2。結(jié)果表明,在7個(gè)月內(nèi),AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的變化均在定值結(jié)果不確定度范圍內(nèi),說明其具有較好的穩(wěn)定性。

表2 AMOZ樣品穩(wěn)定性考察

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

表3是氣相色譜法、液相色譜法和差示掃描量熱法3種不同原理的定值方法對(duì)AMOZ主成分的定值結(jié)果。

表3 AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果 %

水分分析采用卡爾費(fèi)休水分滴定儀對(duì)AMOZ樣品進(jìn)行了8次測量。該方法測得AMOZ樣品水分含量為0.099 0%。

無機(jī)雜質(zhì)分析采用Pyris1TGA儀器對(duì)AMOZ樣品進(jìn)行測量，測得AMOZ樣品灰分含量為0.22%。

AMOZ的標(biāo)準(zhǔn)值采用質(zhì)量平衡法，即采用HPLC、GC和DSC 3種定值技術(shù)測量值的平均值扣除水分、灰分等無機(jī)雜質(zhì)之后的結(jié)果。AMOZ的標(biāo)準(zhǔn)值為：

P=[1-(0.990%+0.22%)]×99.6%=98.39%

2.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度

定值結(jié)果的不確定度由3部分組成:標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程引入的不確定度。

(1)不均勻性引入的不確定度uh

uh包括樣品加工過程不均勻性、分裝不均勻性以及平行實(shí)驗(yàn)分析間的偏差。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性以獨(dú)立測量的平行試驗(yàn)來表示,即以瓶間與瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。由均勻性檢驗(yàn)結(jié)果可知,該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好,因此由不均勻性引入的不確定度可以忽略,即uh= 0。

(2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度uT

uT以穩(wěn)定性考察結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。在穩(wěn)定性考察中要注意定值結(jié)果是否出現(xiàn)逐漸增大或減少的趁勢,如果出現(xiàn)較大的方向性變化趨勢,則應(yīng)考慮選擇更優(yōu)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保存方式。在穩(wěn)定性監(jiān)測期間內(nèi),穩(wěn)定性變化很小,證明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是穩(wěn)定的,由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度可以忽略,即uT= 0。

(3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程引入的不確定度

①液相色譜檢測引入的不確定度(ud)

液相色譜法測量A類不確定度是由重復(fù)性引入的不確定度u1，由10次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，即u1=0.04%。

B類不確定度是由各組分在不同檢測波長下響應(yīng)差異引入的不確定度u2，測量結(jié)果如表4所示，其中：

u2-i=Bi,max,λ-Bi，定值，λ

合成液相色譜的不確定度：

表4 樣品AMOZ不同波長下引入的不確定度

注：“-”為未檢出。

②氣相色譜檢測引入的不確定度

氣相色譜法定值A(chǔ)類標(biāo)準(zhǔn)不確定度由測量重復(fù)性引入的不確定度u1，由10次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，即u1=0.04%。

B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度由實(shí)驗(yàn)測量的各量的變化來估算，AMOZ樣品的雜質(zhì)約為0.17%，在純度測定時(shí)，由于AMOZ和雜質(zhì)在選擇的測量條件下靈敏度不同，對(duì)雜質(zhì)測量帶來的誤差估計(jì)為即50%，即u2=0.09%。

合成GC檢測標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

③DSC檢測引入的不確定度

差示掃描量熱法測定A類不確定度(重復(fù)性引入的不確定度)u1由測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，即u1=0.04%。

B類不確定度u2由實(shí)驗(yàn)測量中各量的變化來計(jì)算，即：

合成DSC法分析不確定度：

④水分引入的不確定度:根據(jù)水分測定結(jié)果,不確定度為每克樣品中水分的含量與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的乘積，即uwater=0.01%。

⑤無機(jī)雜質(zhì)引入的不確定度: 根據(jù)TGA測定無機(jī)雜質(zhì)的結(jié)果, 不確定度為每克樣品中灰分的含量與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的乘積，即uinorganic=0.12%。

因此定值過程引入的不確定度：

(4)合成不確定度與擴(kuò)展不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的合成不確定度uc為:

取包含因子k=2,則擴(kuò)展不確定度為:

U=kuc=0.50%

AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.28%，擴(kuò)展不確定度U=0.50%(k=2)。

3 結(jié)語

采用液相色譜、氣相色譜面積歸一化法和差示掃描量熱法對(duì)研制的AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，對(duì)不確定度進(jìn)行了評(píng)估。研制的AMOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為99.28%，擴(kuò)展不確定度為0.50%。

[1] 朱堅(jiān).高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測肉和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2003, 24(增刊):121-122.

[2] Commission regulation(EC) 2002/250 Off. J Europe Communities,2002,84:75.

[3] Commission regulation(EC) 2002/251 Off. J Europe Communities，2002，84：77.

[4] 安強(qiáng), 王偉, 劉瑤涵. 溶劑萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定動(dòng)物源食品中硝基呋喃代謝產(chǎn)物[J].分析化學(xué), 2009, 37(增刊):278.

[5] Alexander Leitner, Peter Z?llner, Wolfgang Lindner. Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A,2001,939:49-58.

[6] GB/T 18932.24-2005 蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的測定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].