李軍，朱清華，馬俊英，王博，劉靜，張云，鞠建華*

(1.中國科學(xué)院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室廣東省海洋藥物重點實驗室中國科學(xué)院海洋微生物中心中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣東廣州510301;2.中國科學(xué)院研究生院，北京100049;3.德州學(xué)院生物系，山東德州253023)

潮霉素A是一種天然的抗生素，1953年第一次從吸水鏈霉菌NRRL 2388的發(fā)酵產(chǎn)物中被分離得到［1］，由5-脫氫-α-L-巖藻糖、(E-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸和2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇3個結(jié)構(gòu)單元組成。早期的研究顯示，潮霉素A具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗菌活性［2］(G+、G－)、抗紅細(xì)胞凝聚活性和抗密螺旋體活性［3］及免疫抑制活性［4］等。進(jìn)一步的研究表明，潮霉素A抗菌作用機理為其通過與核糖體50S亞基結(jié)合，抑制核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)的合成［5］;潮霉素A具有抗紅細(xì)胞凝聚活性和抗密螺旋體活性，暗示其在豬密螺旋體引起的痢疾治療方面的潛在應(yīng)用價值［3］。最新的研究結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)類似物(甲氧潮霉素A)具有去除雜草的生物活性［6］。正因為潮霉素A具有新穎的結(jié)構(gòu)特點，良好的生物學(xué)活性，獨特的作用機制及潛在應(yīng)用價值，引起了國內(nèi)外眾多學(xué)者對其研究開發(fā)的興趣。本文就潮霉素A的結(jié)構(gòu)特點、生物合成途徑以及生物合成基因的工程改造等方面進(jìn)行綜述。

1 潮霉素A的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其類似物

在吸水鏈霉菌NRRL 2388(Streptomyces hygroscopicus NRRL 2388)的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了潮霉素A(Ⅰ)。從發(fā)酵產(chǎn)物中將其分離，并進(jìn)行化學(xué)手段分析，得出它的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由3個結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成:5-脫氫-α-L-巖藻糖(結(jié)構(gòu)單元A)［5-dehydro-α-L-fucofuranose］、(E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸(結(jié)構(gòu)單元B)［(E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-methylacrylic acid］和2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇(結(jié)構(gòu)單元C)［2L-2-amino-2-deoxy-4，5-O-methylene-neo-inositol］［7-8］。在同一發(fā)酵產(chǎn)物中也分離得到了甲氧潮霉素A(methoxyhygromycin A，Ⅱ)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

利用以潮霉素A為基礎(chǔ)所進(jìn)行的化學(xué)半合成［9］，得到了大量的潮霉素A的結(jié)構(gòu)類似物，比如:5''-二氫甲氧基-潮霉素A［5''-dihydromethoxyhygromycin A，Ⅲ］、5''-二氫潮霉素A(DHHA)［5''dihydrohygromycin A，Ⅳ］和潮霉素A苷元(hygromycin A aglycon，Ⅴ)等。通過化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系研究表明氨基環(huán)醇結(jié)構(gòu)模塊是其顯示抗菌活性的藥效基團(tuán)，而5-脫氫-α-L-巖藻糖模塊則不是其活性的必需基團(tuán)，它可以被疏水性的烯丙基團(tuán)所取代。如果(E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸模塊中的甲基被丙基或烯丙基等基團(tuán)所取代的話，整個化合物的抗菌活性會降低。核苷類抗生素A201A(Ⅵ)有著與潮霉素A相類似的結(jié)構(gòu)單元，它也具有廣譜的抗菌活性［10］。

圖1 潮霉素A及其類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of hygromycin A and its structurally related analogues

2 潮霉素A的生物合成基因簇及其生物合成過程

潮霉素A的相關(guān)生物合成基因簇已被成功克隆。潮霉素A的生物合成基因簇約長31.5 kb，有29個開放閱讀框(圖2)，分別命名為hyg1～29，其中包括調(diào)控基因、抗性基因和負(fù)責(zé)3個結(jié)構(gòu)單元合成的結(jié)構(gòu)基因［11］。通過生物信息學(xué)分析，各基因的功能如表1所示。其中，基因hyg1和hyg3是調(diào)控基因;另外幾個基因如hyg6或hyg29、hyg19、hyg21和hyg28，它們分別編碼甲基轉(zhuǎn)移酶、跨膜蛋白、磷酸轉(zhuǎn)移酶、ABC運輸?shù)鞍祝@些蛋白質(zhì)都與菌株本身抵抗潮霉素A的作用有關(guān)［12］。

對hyg基因簇進(jìn)行同源比對及功能分析(表1)后，推測有幾個基因可能參與從NDP-甘露糖到5-脫氫-α-L-巖藻糖的生物合成［13］。hyg5被認(rèn)為編碼GDP-D-甘露糖-4，6-脫水酶(MDH)，負(fù)責(zé)催化活化的NDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為NDP-4-甲基-6-脫氧甘露糖;潮霉素A合成的重要步驟是NDP-L-巖藻糖的生成，此過程可能由基因hyg23編碼產(chǎn)物所催化，因為hyg基因的推測產(chǎn)物與L-巖藻糖合成酶有超過60%的同源性;接下來是由吡喃六環(huán)糖轉(zhuǎn)變?yōu)檫秽瀛h(huán)糖，這步反應(yīng)可能由與葡萄糖轉(zhuǎn)移酶同源性很高的基因hyg20編碼的蛋白催化完成［14］;5-脫氫巖藻糖合成的最后一步可能是基因hyg26編碼的脫氫酶來完成。此外，基因hyg16編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)5-脫氫-α-L-巖藻糖結(jié)構(gòu)單元和(E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸結(jié)構(gòu)單元之間的糖苷鍵的形成。巧合的是，在抗生素A201A的生物合成中也涉及到葡萄糖苷鍵的形成，該反應(yīng)可能由生物合成基因簇中的結(jié)構(gòu)基因ata5編碼的蛋白催化執(zhí)行的，Ata5蛋白與Hyg16蛋白有63%的相似度［10］。

圖2 潮霉素A的生物合成基因簇的組織結(jié)構(gòu)Fig.2 Organization of hygromycin A biosynthetic gene cluster in Streptomyces hygroscopicus NRRL 2388

表1 潮霉素A生物合成基因簇中各基因的功能［11］Table 1 Deduced functions of open reading frames in the hygromycin A biosynthetic gene cluster［11］

續(xù)表

在結(jié)構(gòu)單元B合成途徑中，涉及到基因hyg9～15、hyg27、hyg4、hyg22。該模塊的合成前體是4-羥基苯甲酸，它由基因hyg4編碼的分支酸裂合酶催化分支酸而得到。分支酸產(chǎn)生于莽草酸途徑，這條途徑的關(guān)鍵步驟是由DAHP(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，3-脫氧-D-阿拉伯酸-庚酮糖-7-磷酸)合成酶催化反應(yīng)［15］的，芳香族酸通過變構(gòu)機制對DAHP(的活性或含量)進(jìn)行反饋抑制調(diào)節(jié)［16］。實驗表明，在潮霉素A生物合成中，基因hyg27編碼一種與DAHP合成酶同源的功能蛋白;基因hyg2編碼的蛋白質(zhì)與4-羥基苯甲酸羥化酶相似，可能催化了3，4-二羥基苯甲酸的合成，目前不能確定羥化反應(yīng)的底物是4-羥基苯甲酸還是之后的反應(yīng)中間體;然后，3，4-二羥基苯甲酸(或4-羥基苯甲酸)可能在基因hyg12的蛋白產(chǎn)物的催化下形成一個硫酯類化合物，基因hyg12的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與乙酰輔酶A連接酶家族相類似;之后，通過基因hyg9、hyg13(編碼的蛋白產(chǎn)物與?；d體蛋白ACP類似)，基因hyg22(蛋白產(chǎn)物是?；D(zhuǎn)移酶AT［17-19］)，基因hyg10(編碼β-酮脂酰合酶KS［20］)以及基因hyg11的協(xié)同作用，得到化合物3-(3，4-二氫苯基)-3-羥基-2-甲基-丙酰ACP。最后，通過基因hyg14和hyg15編碼的功能蛋白3-羥酰基ACP脫水酶(3-hydroxylacyl ACP dehydratase)和3-酮脂酰ACP還原酶(3-ketoacyl ACP reductase)的催化作用，轉(zhuǎn)變?yōu)?E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸ACP。

圖3 潮霉素A在NRRL 2388中可能的生物合成過程Fig.3 Proposed biosynthetic pathway of hygromycin A in Streptomyces hygroscopicus NRRL 2388

潮霉素A結(jié)構(gòu)單元C的合成起始于6-磷酸-葡萄糖。該底物依次經(jīng)過基因hyg18編碼的1-磷酸肌醇合酶和基因hyg25編碼的肌醇單磷酸酶的催化形成肌醇。然后，在基因hyg17編碼產(chǎn)生的肌醇脫氫酶的催化下，肌醇C5位置上發(fā)生氧化反應(yīng)，再通過hyg8基因編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶的作用，形成2L-2-氨基-2-脫氧新肌醇［21］。另外，在潮霉素A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有1個在C4和C5之間的亞甲基橋，現(xiàn)在還不確定它形成于哪個階段的，推測有1個甲基在這條合成途徑的倒數(shù)第2個步驟上被轉(zhuǎn)移到了C5上，形成了2L-2-氨基-2-脫氧-5-O-甲基新肌醇，而2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇的最后形成還需要發(fā)生一個獨特的氧化反應(yīng)。而這類氧化反應(yīng)在糖類反應(yīng)中也是少見的。

3 潮霉素A生物合成基因簇的基因功能驗證及其自抗性機制

目前，一些分子生物學(xué)實驗證明了hyg生物合成基因簇的功能，為進(jìn)一步弄清潮霉素A的生物合成過程提供了很多信息［11，22］。同源重組就是一個研究基因功能的良好方法。

利用同源重組的方法，將兩端與hyg26基因序列同源而中間具有阿普拉霉素抗性標(biāo)記的DNA片段導(dǎo)入野生型吸水鏈霉菌NRRL 2388中，用以替換hyg26基因，得到SCH30突變株［11］。將野生型和突變型菌株發(fā)酵處理，通過HPLC檢測，可以看到，在野生型中既有潮霉素A又有甲氧潮霉素A;而突變株SCH30中這2種化合物都不存在，但出現(xiàn)了另外3個較高的峰段。經(jīng)分離純化后，3種化合物被證明是潮霉素A類似物:5''-二氫甲氧基-潮霉素A［5''-dihydromethoxy-hygromycin A］、5''-二氫潮霉素A(DHHA)［5''-dihydrohygromycin A］、(E)-3-(3-羥基-4-O-α-巖藻呋喃苯基)-2-甲基丙烯酸［(E)-3-(3-hydroxy-4-O-α-fucofuranosylphenyl-2-methylacrylicacid］。根據(jù)對SCH30發(fā)酵產(chǎn)物的研究，推測:形成5-脫氫-α-L-巖藻呋喃糖模塊的最后一步是由Hyg26催化的α-L-巖藻呋喃糖的氧化過程，但無法確定這步氧化過程發(fā)生于2模塊之間糖苷鍵的形成順序。

任何一種產(chǎn)生抗生素的微生物都會具備一種或幾種自身保護(hù)機制，而編碼具有自我保護(hù)功能的蛋白質(zhì)的基因一般就存在于抗生素生物合成基因簇內(nèi)部，并作為其中的一部分，與其他基因起協(xié)調(diào)作用［23］。在潮霉素A的生物合成基因簇中，hyg6或hyg29編碼甲基轉(zhuǎn)移酶可能使潮霉素A失活;hyg19和hyg28編碼跨膜運輸?shù)鞍?，可能將潮霉素A轉(zhuǎn)運到膜外而進(jìn)行保護(hù)自身;hyg21編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶，使潮霉素A發(fā)生磷酸化而使其失活。體外試驗表明磷酸化的潮霉素A(HA-P)失去了抑菌活性，另外，對hyg21基因雙交突變株進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中存在潮霉素A，但含量較野生型下降了90%以上，這說明Hyg21對潮霉素A的合成產(chǎn)量有重要影響。但突變株與野生型菌株對潮霉素A有同等的抗性，這說明在吸水鏈霉菌NRRL 2388中存在多種自我保護(hù)機制，將潮霉素A磷酸化使其失活只是其中之一。

基因hyg19編碼質(zhì)子梯度依賴型轉(zhuǎn)運蛋白，它能將潮霉素A轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，保護(hù)菌株不被傷害。基因hyg19的存在對于潮霉素A的合成是必要的。有研究表明敲除基因hyg19會有兩種結(jié)果，其一是突變株中的潮霉素A的產(chǎn)量會減少，并且有DHHA中間體產(chǎn)生。DHHA對大腸埃希菌有微弱的抗菌活性和微弱的體外蛋白合成抑制劑活性。其二是突變株沒有增加對潮霉素A的敏感性，而基因hyg19和hyg21均被敲除的突變株對潮霉素A的敏感性則大大增強。這些資料表明，在合成和轉(zhuǎn)運潮霉素A方面，Hyg21和Hyg19是起協(xié)同作用，同時Hyg19蛋白兼有參與合成潮霉素A和轉(zhuǎn)運潮霉素A的雙重功能［24］。

4 結(jié)語與展望

潮霉素A表現(xiàn)出的廣泛的生物學(xué)活性，新穎的結(jié)構(gòu)特征，獨特的作用機制及其潛在的應(yīng)用價值，顯示出對其進(jìn)行生物合成過程和合成機制研究的重要意義。組合生物合成是上世紀(jì)90年代中后期發(fā)展起來的新技術(shù)，隨著后來基因測序技術(shù)、基因重組新技術(shù)(如PCR-targeting)和異源基因表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，組合生物合成已在生物學(xué)領(lǐng)域帶來了革命性的變化，也給化學(xué)學(xué)科創(chuàng)造新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和構(gòu)建化合物庫帶來了新的方法［25-27］。利用生物信息學(xué)技術(shù)，潮霉素A生物合成相關(guān)的基因簇已被克隆，并根據(jù)潮霉素A的結(jié)構(gòu)，推測了該抗生素的生物合成途徑。另外，利用同源重組等手段，已得到功能基因的缺失多個突變菌株，并結(jié)合HPLC、LC-MS等技術(shù)，已經(jīng)初步確定了部分基因的功能。而隨著對其生物合成各基因功能研究的深入，各基因在其生物合成過程中的作用將會得到進(jìn)一步的闡明，功能新穎、作用機制獨特的酶將會被發(fā)現(xiàn)并加以利用。

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