程琳琳, 王 璇, 彭文濤, 周立軍, 王紀(jì)坤, 謝貴水, 安 鋒

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所, ?？?571101;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站, 海南 儋州 571737;3.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院, ?？?570228)

潮霉素B(以下簡稱潮霉素)作為氨基糖苷類正糖霉素族Ⅱ類抗生素[1]的代表之一,被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域,常作為轉(zhuǎn)化的選擇劑[2],具有重要的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。潮霉素在20世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn),它主要通過靶向細(xì)菌中的30 S核糖體亞基[3]和真核細(xì)胞中的核糖體[4],從而阻礙蛋白質(zhì)的合成[5],最終致使細(xì)胞逐漸褐化直至死亡[6]。潮霉素具有抑菌、殺蟲功能,可作為生物學(xué)研究過程中遺傳操作選擇劑[7],被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和生物工程中。擬南芥(ArabidopsisthalianaL. Heynh.)是十字花科擬南芥屬的草本植物,因其體型小、生命周期短、易于種植管理、基因組僅有5條染色體并已完成測序等優(yōu)點(diǎn),成了遺傳學(xué)的模式生物,對生物化學(xué)、植物生理、代謝組、發(fā)育生物、生物合成、基因工程等學(xué)科領(lǐng)域的發(fā)展具重要作用[8]。在對不同物種目的基因功能驗(yàn)證分析中,以具潮霉素抗性的載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化,適宜濃度的潮霉素篩選是獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系的有效途徑[9]。在擬南芥的潮霉素篩選中,賈慶利[10]發(fā)現(xiàn),潮霉素濃度大于等于30 mg/L 時(shí),野生型擬南芥種子放置于培養(yǎng)基上第10天,培養(yǎng)基上無綠色幼苗。徐曉寒等[11]以25 mg/L的潮霉素作為篩選劑,獲得純合的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。陳錫等[12]用30 mg/L的潮霉素對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行了篩選。張勇等[13]以添加50 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性種子。武亞丹等[14]、張春微等[15]進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥種子篩選的潮霉素濃度均為25 mg/L。Lin等[16]以50 mg/L的潮霉素對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行了篩選。適宜的潮霉素濃度既可保證擬南芥種子的正常萌發(fā)、胚根伸長、根系發(fā)育與幼苗生長,又可有效降低轉(zhuǎn)基因種子的假陽性率,減少轉(zhuǎn)基因株系后續(xù)篩選的工作量,提高以擬南芥進(jìn)行目的基因功能驗(yàn)證的準(zhǔn)確率與效率。然而,采用種子萌發(fā)及幼苗生長相關(guān)指標(biāo)的差異性比較進(jìn)行潮霉素適宜濃度的篩選,僅為同一指標(biāo)間數(shù)據(jù)的比較,而且由于測定數(shù)據(jù)之間的誤差,結(jié)果具有一定的局限性[17]。而變異系數(shù)-熵權(quán)法的復(fù)合權(quán)重協(xié)調(diào)分配各種指標(biāo)的權(quán)重,避免單一指標(biāo)差異過小的缺陷[18],再將變異系數(shù)-熵權(quán)組合權(quán)重運(yùn)用到TOPSIS法(Technique for Order Preference by Similarity to Ideal Solution)中,最終得到優(yōu)化的評價(jià)方案[19]。因此,以不同濃度潮霉素對擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長相關(guān)生理、形態(tài)指標(biāo)差異性研究入手,結(jié)合基于變異系數(shù)-熵權(quán)法復(fù)合權(quán)重的TOPSIS法來評價(jià)相應(yīng)指標(biāo)的綜合效果,確定擬南芥種子進(jìn)行潮霉素篩選的最適宜濃度,并根據(jù)幼苗生長形態(tài)確定篩選時(shí)期,為擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性種子篩選及目的基因功能驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取成熟度高、色澤度好、較飽滿、整齊度較一致的野生型擬南芥(Columbia-0)種子為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方 法

參照何云龍等[20]的方法對擬南芥種子進(jìn)行滅菌,用牙簽將種子分別點(diǎn)播于含有潮霉素(濃度為0,20,30,40,50 mg/L)的1/2 MS培養(yǎng)基上,潮霉素濃度分別為0(ck),20,30,40,50 mg/L,分別記為M0、M1、M2、M3、M4,3次重復(fù)。點(diǎn)播后放入光照培養(yǎng)箱中,參照徐曉寒等[11]的參數(shù)設(shè)置光照培養(yǎng)箱。從點(diǎn)播的第2天開始,每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù),種子萌發(fā)以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)[21]。參照李云等[22]的方法統(tǒng)計(jì)第3天發(fā)芽勢。第7天,采用Leica M 205 FA熒光體視顯微鏡觀察幼苗生長及根系發(fā)育情況,并以LAS圖像采集分析系統(tǒng)測定主根長度;采用METTLER TOLEDO MX 5百萬分之一天平,參照高俊鳳[23]的方法測定幼苗鮮重、干重并計(jì)算其相對含水率。連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)無變化,發(fā)芽結(jié)束[24],參照岳永江等[25]的方法統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率。第13天,統(tǒng)計(jì)各處理幼苗的失綠死亡個(gè)數(shù),并計(jì)算各處理的幼苗失綠死亡率。在點(diǎn)播的第2,3,7,13天以LAS圖像采集分析系統(tǒng)拍攝種子萌發(fā)及幼苗生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性方差分析(多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法),用OriginPro 2018軟件進(jìn)行繪圖,所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。

參照葉惠娟等[26]的方法對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理(以獲得適宜的潮霉素篩選濃度為目標(biāo),由此以抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的指標(biāo)為正向指標(biāo),以促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長的指標(biāo)為負(fù)向指標(biāo)),萌發(fā)率、第3天發(fā)芽勢、第7天鮮重、干重、含水率、主根長度、第13天植株失綠死亡等7項(xiàng)指標(biāo)所有數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的指標(biāo)值分別記為X1、X2、X3、……、X7;參照張媛媛等[19]的方法進(jìn)行變異系數(shù)-熵權(quán)法組合權(quán)重及TOPSIS法的綜合得分計(jì)算,各指標(biāo)的變異系數(shù)法權(quán)重記為dj(j=1,2,3,……,7),各指標(biāo)的熵權(quán)法權(quán)重記為ej(j=1,2,3,……,7),各指標(biāo)的復(fù)合權(quán)重記為Wj(j=1,2,3,……,7),不同處理與正/負(fù)理想解的歐式距離、接近度分別記為Dj+、Dj-、Cj,計(jì)算過程中需修正部分?jǐn)?shù)據(jù)[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度潮霉素對擬南芥種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢的影響

種子萌發(fā)率可以有效衡量種子質(zhì)量。在種子點(diǎn)播的第2天,不同濃度潮霉素處理下,擬南芥種子均開始萌發(fā)。隨著潮霉素濃度的不斷增大,萌發(fā)率呈逐漸下降的趨勢。M1、M2、M3、M4的萌發(fā)率均低于M0的萌發(fā)率。M0、M1、M2的萌發(fā)率分別與M4的萌發(fā)率差異達(dá)顯著水平(p<0.05),但這3個(gè)處理之間的差異并不顯著。M0、M1分別與M3、M4的萌發(fā)率差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。從圖1可看出,20～30 mg/L的潮霉素對擬南芥種子的萌發(fā)無顯著影響,而40～50 mg/L的潮霉素會(huì)顯著影響種子的萌發(fā)率。在第2天種子開始萌發(fā)時(shí),5種處理的擬南芥種子的外觀形態(tài)也無顯著差異(圖2)。

圖1 不同濃度潮霉素對擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

注:每一行從左至右依次為處理M0、M1、M2、M3、M4;每一列從上至下依次為培養(yǎng)的第2,3,7,13天;圖中紅色標(biāo)尺代表1 mm。

發(fā)芽勢為判定種子發(fā)芽整齊度和發(fā)芽速度的重要指標(biāo)。如圖1所示,在添加不同濃度潮霉素的處理中,擬南芥種子第3天的發(fā)芽勢均低于對照。而且,隨著潮霉素濃度的增加,第3天發(fā)芽勢呈先增后降的趨勢。M0和M2分別與另外3種處理相比,第3天發(fā)芽勢的差異均達(dá)顯著水平(p<0.05),但二者并無顯著差異。添加30 mg/L的潮霉素處理第3天的發(fā)芽勢最高,達(dá)42.716 3%,顯著高于20 mg/L、40 mg/L、50 mg/L處理的16.361 8%,19.566 9%,22.326 8%。第3天,擬南芥種子在不同處理中生長狀態(tài)具有明顯的不同:M0的種子胚根根毛較為密集,而M1、M2的種子胚根根毛較M0的短且稀疏,M3、M4的種子胚根幾乎無根毛(見圖2)。潮霉素的添加明顯抑制了種子胚根根毛的發(fā)育與生長。隨著潮霉素濃度的增加抑制作用越明顯。

2.2 不同濃度潮霉素對擬南芥幼苗鮮重、干重、相對含水率的影響

第7天,潮霉素對幼苗鮮重的影響如圖1所示。潮霉素對擬南芥幼苗的鮮重具一定的抑制作用,隨著潮霉素濃度的增加,幼苗的鮮重逐漸降低。4種濃度潮霉素處理的幼苗鮮重與對照的差異均達(dá)顯著水平(p<0.05),但這4者之間的差異并不顯著,即添加20～50 mg/L的潮霉素對擬南芥幼苗鮮重的影響差異不顯著。

幼苗干重反映了植物利用種子貯藏物質(zhì)和從外界吸收營養(yǎng)的能力。從圖1可以看出,第7天幼苗干重隨著潮霉素濃度的增加呈逐漸下降的趨勢。潮霉素顯著阻礙了幼苗吸收利用種子內(nèi)和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì),抑制了幼苗干物質(zhì)的積累,并隨著濃度的增加,抑制作用不斷增強(qiáng)。M1處理下幼苗干重與M2、M3、M4處理的幼苗干重的差異達(dá)顯著水平(p<0.05),但是M2、M3、M4處理之間的差異并不顯著,即當(dāng)潮霉素濃度大于等于30 mg/L時(shí),潮霉素影響擬南芥幼苗干物質(zhì)累積的效果差異不顯著。

植物體內(nèi)供水、保水機(jī)制綜合作用的表現(xiàn)就是相對含水率。由圖1可見,隨著潮霉素濃度的升高,擬南芥幼苗的相對含水率逐漸降低。與對照相比,添加潮霉素顯著影響到擬南芥幼苗從培養(yǎng)基中吸收水分與自身保水的能力。20 mg/L的潮霉素處理下擬南芥幼苗的相對含水率為82.823 4%,與40 mg/L、50 mg/L潮霉素處理下(76.106 5%,75.201 1%)相比,差異達(dá)顯著水平(p<0.05),而與30 mg/L處理下(79.294 8%)相比,降幅為4.260 4%,并未達(dá)到顯著水平;40 mg/L比30 mg/L處理的降幅為4.020 8%,50 mg/L比30 mg/L處理的降幅為5.162 6%。結(jié)果表明,40～50 mg/L的潮霉素會(huì)顯著影響擬南芥幼苗從培養(yǎng)基內(nèi)吸收水分及體內(nèi)水分代謝的平衡。

2.3 不同濃度潮霉素對擬南芥幼苗主根長度的影響

種子萌發(fā)時(shí),胚根最先突破種皮,然后伸長發(fā)育為主根,根系的生長發(fā)育情況決定著植物生長發(fā)育的多種生理功能。從圖1可以看出,潮霉素嚴(yán)重抑制了根系的生長,隨著潮霉素濃度的增加,幼苗主根長度急劇降低。與M0相比,M1、M2、M3、M4處理的幼苗主根長度分別降低了95.851 1%,98.614 5%,98.725 1%,98.931 5%,這4種處理與對照的差異均達(dá)顯著水平(p<0.05);從M2(30 mg/L)開始降幅逐漸變小,M2比M1降低了66.606 3%,M3比M2降低了7.978 3%,M4比M3降低了16.195 6%,M1、M2、M3、M4之間的差異不顯著。第7天,對照擬南芥幼苗已長出兩片真葉,而其他處理均未出現(xiàn)真葉;M1、M2處理的絕大部分?jǐn)M南芥幼苗子葉已展開,胚根已完全脫離種皮,而M3、M4處理的幼苗子葉并未展開,且大部分子葉還未突破種皮。由此可以看出,潮霉素極大程度上影響了幼苗根系的生長發(fā)育,繼而影響幼苗的生長發(fā)育,除對照葉片濃綠外,其他處理的葉片顏色都有一定的變化,且子葉體型較小(見圖2)。

2.4 不同濃度潮霉素對擬南芥幼苗失綠死亡的影響

潮霉素對擬南芥幼苗葉綠素的形成具有明顯的抑制作用,使葉片無法進(jìn)行正常的光合作用,導(dǎo)致幼苗停止生長并最終死亡。培養(yǎng)基中潮霉素的存在,致使幼苗出現(xiàn)不同程度的失綠。從第7天開始,各處理的幼苗從子葉開始出現(xiàn)失綠現(xiàn)象。第10天開始,幼苗呈現(xiàn)出白化、黃化、褐化現(xiàn)象,嚴(yán)重時(shí)會(huì)逐漸死亡。第13天,對照的擬南芥幼苗已長出3～4片真葉,各處理的擬南芥幼苗僅剩零星的存活(見圖2)。隨著潮霉素濃度的增大,不同處理的擬南芥幼苗失綠死亡率逐漸增大,M3、M4兩種處理的幼苗失綠死亡率最高,達(dá)99.104 1%和100%,與其他處理的差異均達(dá)顯著水平(p<0.05),但這兩種處理間的差異并未達(dá)顯著水平。

與M0相比,M1、M2處理的失綠死亡率也達(dá)到了顯著水平(p<0.05),且二者之間也具有顯著性差異(p<0.05),分別為12.326 2%和86.688 4%(見圖1)。從圖1可知,從30 mg/L潮霉素處理開始幼苗失綠死亡率急劇升高,與20 mg/L潮霉素處理相比,30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L潮霉素處理的失綠死亡率增幅分別為603.285 7%,704.011 8%和711.280 0%。

2.5 不同濃度潮霉素處理對擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長的綜合分析

由圖1可知,擬南芥種子萌芽及幼苗生理、形態(tài)指標(biāo)并不是隨著潮霉素濃度的增加呈現(xiàn)同樣的變化趨勢,各處理間相應(yīng)指標(biāo)之間的差異性也不盡相同,單純分析這些數(shù)據(jù),無法準(zhǔn)確判斷何種濃度潮霉素適宜于轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選。引入變異系數(shù)-熵權(quán)法復(fù)合權(quán)重的TOSIS法可以綜合分析各指標(biāo),全面反映潮霉素抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的情況。首先,對不同處理下擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生理、形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行無量綱化處理(見表1)。由表1可以得出,在抑制種子萌發(fā)和幼苗生長方面,并不是M4處理下的所有指標(biāo)數(shù)據(jù)都是最大值,X2的最大值為M1處理,X3最大的是M3處理,X4最大的是M3處理。根據(jù)各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)計(jì)算出各指標(biāo)的變異系數(shù)法權(quán)重、熵權(quán)法權(quán)重和組合權(quán)重(見表2)。由表2可知,最大與最小權(quán)重指標(biāo)組合權(quán)重的差值為0.204 5,而其變異系數(shù)法、熵權(quán)法權(quán)重的差值分別為0.088 0、0.105 9;復(fù)合權(quán)重排名第1位的指標(biāo)(種子萌發(fā)率)權(quán)重為0.286 1,分別是其變異系數(shù)法、熵權(quán)法權(quán)重的1.413 4倍、1.339 4倍;復(fù)合權(quán)重排名最后1位的指標(biāo)(第7天主根長度)權(quán)重,分別是其變異系數(shù)法、熵權(quán)法權(quán)重的71.288 1%、75.682 7%。從最終復(fù)合權(quán)重計(jì)算出的各指標(biāo)權(quán)重可以看出,在衡量潮霉素阻礙種子萌發(fā)和幼苗生長方面,種子萌發(fā)率、第13天失綠死亡率、種子第3天萌發(fā)勢、第7天相對含水率為組合權(quán)重排序前4的指標(biāo)。結(jié)合各指標(biāo)無量綱化處理的數(shù)據(jù)及組合權(quán)重,可以得到各指標(biāo)的加權(quán)規(guī)范化決策矩陣(也叫加權(quán)矩陣,見表3)。由各指標(biāo)加權(quán)規(guī)范化決策矩陣可以看出,7個(gè)指標(biāo)的正理想解依次為0.286 1、0.147 3、0.083 4、0.093 5、0.099 8、0.081 5、0.208 4,7個(gè)指標(biāo)的負(fù)理想解均為0。最終,計(jì)算不同處理分別與正、負(fù)理想解的歐式距離和接近度,并進(jìn)行排序(見表4)。根據(jù)接近度排序可知,隨著潮霉素濃度的增大,對擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長抑制的作用逐漸增強(qiáng), 30 mg/L潮霉素處理的接近度為0.531 5,最接近抑制效果的50%。綜合考慮組合權(quán)重排序前4的指標(biāo),在1/2 MS培養(yǎng)基中潮霉素抑制擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長的臨界濃度為30 mg/L,可以作為利用1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行含潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選的參考濃度值。同時(shí),在種子點(diǎn)播的7～10 d,抗性幼苗需要及時(shí)移栽,以利于其后期生長。

表1 各指標(biāo)無量綱處理

表2 各指標(biāo)權(quán)重

表3 各指標(biāo)加權(quán)矩陣

表4 不同處理的組合權(quán)重TOPSIS綜合評價(jià)及排序情況

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)及萌發(fā)后的發(fā)育階段對幼苗的形態(tài)建成至關(guān)重要,因此這兩個(gè)時(shí)期對外界環(huán)境的刺激尤為敏感。一旦周圍環(huán)境存在抗生素,其脅迫可對種子的生長發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)的壓力,即效應(yīng)[28],由此而致種子生長發(fā)育變化或者下降,即協(xié)變[29]。種子萌發(fā)期及胚根伸長期的實(shí)驗(yàn)常用于對外界環(huán)境有害物質(zhì)和受脅迫的植物受害程度的評估[30]。在氯霉素、螺旋霉素、壯觀霉素、凡可霉素4種抗生素對番茄種子萌發(fā)和根系發(fā)育的影響研究中,一定濃度的抗生素(10 mg/L的壯觀霉素、100 mg/L的氯霉素、1 000 mg/L的螺旋霉素和凡可霉素)作用7,10 d內(nèi),種子萌發(fā)不受影響,但根系伸長動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞分裂受到影響[31]。以萵苣、紫花苜蓿、胡蘿卜為實(shí)驗(yàn)對象,評估10種抗生素(濃度均為0.1 μg/L、10 μg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L)對種子萌發(fā)和幼苗早期生長的影響,發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)對抗生素濃度不敏感,即使是10 mg/L處理時(shí),種子萌發(fā)率也無明顯下降,但根系伸長為最敏感的節(jié)點(diǎn)[32]。5 μmol(2.22 mg/L)的四環(huán)素處理大白菜時(shí),對照與處理之間萌發(fā)勢無顯著差異,但四環(huán)素通過降低細(xì)胞代謝活性而不是破壞細(xì)胞完整性來抑制胚根伸長[28]。潮霉素對擬南芥種子萌發(fā)影響實(shí)驗(yàn)中,1/2 MS培養(yǎng)基中添加30 mg/L的潮霉素不會(huì)顯著影響擬南芥種子的萌發(fā),但是20 mg/L的潮霉素就已致幼苗主根長度與對照的差異達(dá)顯著水平(p<0.05),說明擬南芥根系對潮霉素較為敏感。在0,0.2,0.8,1.4,2.0 mg/L的環(huán)丙沙星對玉米種子萌發(fā)和根系發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn),添加環(huán)丙沙星能促進(jìn)種子中活性氧的積累,與對照相比,可以顯著縮短萌發(fā)時(shí)間,0.8 mg/L的環(huán)丙沙星縮短萌發(fā)時(shí)間最明顯[33]。在1/2 MS培養(yǎng)基中添加30 mg/L的潮霉素,雖然降低了第3天種子的發(fā)芽勢,但是與對照相比未達(dá)顯著水平,原因可能是一定濃度潮霉素脅迫下,種子積累的活性氧在一定程度上促進(jìn)了種子的萌發(fā),但也對細(xì)胞的代謝具有明顯的抑制,所以添加潮霉素降低了擬南芥種子第3天的發(fā)芽勢。

一旦植物受到環(huán)境的脅迫,植物進(jìn)行生長防御的權(quán)衡后,將有限的可用能量轉(zhuǎn)移到防御機(jī)制的啟動(dòng)中[34]。根系是植物與外界環(huán)境的第一接觸點(diǎn),在逆境脅迫中,根系對營養(yǎng)的吸收被抑制,植物的生長也隨之受抑制,最終導(dǎo)致植物生物量的下降[35]。大于1 mg/L的環(huán)丙沙星即可對水培小麥的地上、地下部的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量具有顯著的抑制作用[36]。0.75 mg/L的土霉素和2 mg/L的恩諾沙星可以顯著降低水培水芹地上部分的生物量[37]。本研究中,20 mg/L的潮霉素處理可顯著抑制擬南芥幼苗干物質(zhì)的積累,≥30 mg/L的潮霉素致幼苗干重降低差異不顯著,即30 mg/L為潮霉素在1/2 MS培養(yǎng)基中抑制擬南芥幼苗干物質(zhì)積累的臨界點(diǎn)。植物的含水率代表了植物從周圍環(huán)境中吸收水分及進(jìn)行物質(zhì)代謝的能力[38]。在添加卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的大白菜幼苗主根和下胚根均縮短,無側(cè)根,根系不發(fā)達(dá)[39],這與本研究中看到的擬南芥幼苗受潮霉素脅迫后的表型是相似的。根系生長受到抗生素的抑制后,從周圍環(huán)境中吸收水分的能力必然下降,導(dǎo)致植物相對含水率的降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,添加潮霉素顯著降低了擬南芥幼苗的相對含水率。

50 mg/L的四環(huán)素阻止小麥細(xì)胞的有絲分裂,蛋白質(zhì)的合成,降低生長相關(guān)酶的活性,使正常細(xì)胞器的功能紊亂,顯著抑制小麥的生長[40]。紅霉素和(或)金霉素處理大白菜種子,降低了大白菜葉綠素含量和光合效率,從而影響大白菜的生理活性[41]。潮霉素抑制蛋白質(zhì)合成和氧化應(yīng)激介導(dǎo)共同導(dǎo)致了水稻細(xì)胞的死亡[42]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn),擬南芥幼苗隨著潮霉素濃度增大,第13天失綠死亡率逐步增大,從30 mg/L處理開始,失綠死亡率急劇升高,這可能是潮霉素嚴(yán)重抑制幼苗植株蛋白質(zhì)合成及植株活性氧的急劇積累所造成的結(jié)果。

變異系數(shù)權(quán)重法和熵權(quán)法是兩種基于多樣性的客觀賦權(quán)方法,可以有效避免人為因素造成的偏差[43]。一般來說,熵權(quán)法中指標(biāo)的信息越多,不確定性越小,熵越小,指標(biāo)的離散程度越大,該指標(biāo)相對應(yīng)的權(quán)重在綜合評價(jià)中就越大[44]。變異系數(shù)法中,某指標(biāo)的變異系數(shù)越大,評價(jià)對象之間的差異越大,該指標(biāo)就越難達(dá)到,所以該指標(biāo)所占權(quán)重就愈大,對評價(jià)結(jié)果的影響力越大[45]。變異系數(shù)權(quán)重法和熵權(quán)法的結(jié)合可有效削弱異常指標(biāo)的影響,確保權(quán)重結(jié)果的真實(shí)合理性[46]。實(shí)驗(yàn)從適宜于轉(zhuǎn)基因擬南芥潮霉素濃度篩選的角度考慮,所以在最初正、逆向指標(biāo)設(shè)定采用了逆向思維。組合權(quán)重的運(yùn)用凸顯了指標(biāo)權(quán)重之間的差異,使得評價(jià)結(jié)果中指標(biāo)權(quán)重的重要性判斷更為明確。排序結(jié)果與相關(guān)案例[19,47]都說明了組合權(quán)重在指標(biāo)評價(jià)中是較為合理的。TOPSIS方法在具有受限選項(xiàng)的多屬性/指標(biāo)決策問題解決方案判定時(shí)是可行的,即最佳的方案(處理)為最接近正理想解且最遠(yuǎn)離負(fù)理想解[48]。但是,單純的TOPSIS方法被認(rèn)為并未考慮多種方案向正理想解和負(fù)理想解分離的相對重要性[49],而組合權(quán)重的引入就解決了這一缺陷。將各方案(處理)中各屬性/指標(biāo)的權(quán)重融入正、負(fù)理想解的判定中,更加客觀評價(jià)各屬性/指標(biāo)的重要性與方案(處理)的可行性。以組合權(quán)重應(yīng)用到TOPSIS法中,可以作為耕地質(zhì)量等級劃分的有效手段[50],為森林火災(zāi)的易損性定量運(yùn)算和定性分析提供了方法[51]。基于逆向思維的指標(biāo)設(shè)定后,組合賦權(quán)的TOPSIS方法得出了不同處理對擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長抑制效果排序,抑制效果隨著潮霉素濃度的降低而降低,30 mg/L的潮霉素處理接近度為0.531 5,抑制效果處于中位。

通過添加不同濃度潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基對擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響研究可以看出,添加潮霉素抑制了擬南芥種子的萌發(fā)和幼苗子葉、真葉及根系的發(fā)育。隨著潮霉素濃度的增加,種子萌發(fā)率逐漸降低,≤30 mg/L的潮霉素不能顯著降低種子萌發(fā)率。添加潮霉素降低了種子第3天的發(fā)芽勢,可能是受種子活性氧積累的影響,僅30 mg/L的潮霉素處理下種子第3天發(fā)芽勢與對照相比未達(dá)到顯著水平(p<0.05)。在潮霉素的脅迫下,擬南芥幼苗根系從1/2 MS培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)被抑制,幼苗生長隨之被抑制,最終導(dǎo)致生物量積累的下降。雖然,各處理之間第7天幼苗鮮重的差異不顯著,但是與20 mg/L潮霉素處理相比,從30 mg/L潮霉素處理開始,幼苗第7天干重被抑制的程度達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。與20 mg/L潮霉素處理相比,30 mg/L潮霉素處理不會(huì)顯著影響到幼苗吸水和水分代謝的平衡。潮霉素通過降低細(xì)胞代謝來降低幼苗根系生長,從30 mg/L潮霉素處理開始,主根長度的降幅逐漸減小,與20 mg/L潮霉素處理相比僅為7.978 3%。潮霉素脅迫導(dǎo)致擬南芥幼苗失綠死亡,第7天幼苗開始出現(xiàn)失綠癥狀,第10天失綠癥狀逐漸嚴(yán)重,第13天添加潮霉素的各處理僅有零星存活。從30 mg/L潮霉素處理開始,幼苗第13天失綠死亡率急劇升高,與20 mg/L潮霉素處理相比增幅達(dá)603.285 7%。根據(jù)變異系數(shù)-熵權(quán)組合賦權(quán)的TOPSIS方法得出的不同濃度潮霉素抑制擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長的正理想解排序?yàn)?M4>M3>M2>M1>M0,最接近于50%抑制效果的為M2處理。根據(jù)潮霉素篩選的要求及實(shí)驗(yàn)相關(guān)的結(jié)果,適宜于1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行擬南芥抗性篩選的濃度為30 mg/L,且7～10 d為相應(yīng)擬南芥幼苗移栽的適宜時(shí)期。