王思琦

[摘 ?要]隨著植物基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物的研究與應(yīng)用已取得了驕人成績(jī)，相繼培育出了一些抗病、抗蟲、抗除草劑和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物的篩選檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展、完善，不但節(jié)省篩選時(shí)間和成本，而且為科學(xué)地評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物提供技術(shù)支持。實(shí)驗(yàn)室常用的轉(zhuǎn)基因植物篩選試劑有草銨膦、卡那霉素和潮霉素。

[關(guān)鍵詞]轉(zhuǎn)基因，篩選，草丁膦，卡那霉素，潮霉素

中圖分類號(hào)：TF046.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）24-0251-01

1983年世界首例轉(zhuǎn)基因植物培育成功，標(biāo)志著人類用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物的開(kāi)始。轉(zhuǎn)基因作物于1987年被允許進(jìn)入田間鑒定試驗(yàn)，1992年開(kāi)始大田產(chǎn)量試驗(yàn)，1995年完成安全性評(píng)價(jià)研究，1996年進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)種植面積為174萬(wàn)hm2，2002年，這一數(shù)字增長(zhǎng)了33倍。目前，產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物主要包括抗除草劑大豆、抗蟲玉米、抗蟲棉花和抗除草劑油菜等，其他具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因作物也呈現(xiàn)良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

植物轉(zhuǎn)基因因受到受體系統(tǒng)的限制，外源基因的轉(zhuǎn)化得率較低，為了獲得有效轉(zhuǎn)化樣本，需要進(jìn)行大量的轉(zhuǎn)化篩選實(shí)驗(yàn)獲得目的樣本，采用何種方法才能解決在大量的待選材料中快速、有效的檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植物或者細(xì)胞;檢測(cè)外源基因是否已經(jīng)整合到植物染色體上;是否正確表達(dá)等一系列問(wèn)題？本文僅對(duì)常用的轉(zhuǎn)基因植物篩選試劑作以簡(jiǎn)要的介紹。

草銨膦（Phosphinothricin，PPT），是一種有機(jī)磷類除草劑（basta的活性成分），其有效成分是膦絲菌素（PPT）。草銨膦主要通過(guò)抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物體內(nèi)氮代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)氨的含量過(guò)高而中毒、葉綠素解體、光合作用受到抑制，最終導(dǎo)致植物死亡。谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)唯一能降解氨毒的酶，能夠去除植物體內(nèi)因硝酸還原反應(yīng)、氨基降解反應(yīng)和光呼吸反應(yīng)過(guò)程所釋放的氨。草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因Bar，從土壤吸水鏈霉菌中分離克隆而來(lái)，其編碼的草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）對(duì)草銨膦專一性高，它可以催化PPT的自由氨基乙酰化，使PPT不能抑制GS的活性，含有該基因的植物具有對(duì)Basta的抗性。

利用Basta篩選轉(zhuǎn)基因植物主要有兩種方法。一種是在幼苗長(zhǎng)出葉片之后直接向待篩選植株噴施Basta，另一種是在MS培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的Basta。培養(yǎng)皿中央點(diǎn)野生型種子作為對(duì)照，其余部分點(diǎn)突變體種子，水平放置培養(yǎng)。挑選發(fā)芽較好的幼苗，移栽到土壤中作為候選突變體培養(yǎng)。不同的植物對(duì)于Basta的敏感程度不同，同一植物不同生長(zhǎng)階段對(duì)于Basta的敏感程度也不同。臨界篩選濃度的判定標(biāo)準(zhǔn)：以野生型幾乎不能發(fā)芽或者發(fā)芽不能存活的basta濃度。根據(jù)擬南芥幼苗的黃化程度和死亡率確定出basta最佳篩選濃度。

卡那霉素（Kanamycin），主要分為鹽酸卡那霉素和硫酸卡那霉素兩種，其本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)生物合成抑制劑，主要用于分子克隆中被作為標(biāo)記基因。卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能夠與葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合，從而干擾蛋白質(zhì)的合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導(dǎo)致植物的死亡。常用nptⅡ基因作為遺傳標(biāo)記基因，其編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ能使植物產(chǎn)生抗卡那霉素特性，對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選。卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能夠與葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合，從而干擾蛋白質(zhì)的合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導(dǎo)致植物的死亡。

利用卡那霉素篩選轉(zhuǎn)基因植物主要是在MS培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的卡那霉素。根據(jù)擬南芥幼苗的死亡率確定出卡那霉素最佳篩選濃度。培養(yǎng)皿中央點(diǎn)野生型種子作為對(duì)照，其余部分點(diǎn)突變體種子，水平放置。挑選發(fā)芽較好的幼苗，移栽到土壤中作為候選突變體培養(yǎng)。

潮霉素（hygromycin），性狀為微黃褐色粉末，毒性較低，具有一定的驅(qū)蟲活性。潮霉素（Hyg）是一種氨基糖苷類抗生素，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)葉綠體和線粒體中的核糖體與延長(zhǎng)因子EF-2的結(jié)合位點(diǎn)，破壞細(xì)胞中核糖體的功能，從而抑制蛋白的合成，使敏感組織褐化死亡。用于真菌、植物、動(dòng)物等生物體外源基因轉(zhuǎn)化的篩選。

目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)比較完善、成熟，但對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)化，還比較難做到定量、定位，因此需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選與檢測(cè)。本文僅對(duì)這三種篩選試劑進(jìn)行簡(jiǎn)要概述，后續(xù)還會(huì)繼續(xù)深入研究，探究不同檢測(cè)目的和要求下，轉(zhuǎn)基因植物最適的篩選檢測(cè)方法，以期得到高效、快速、便捷、安全的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Yasushi N.， et al.Simultaneous LC-MS/MS analysis of Glyphosate， Glufosinate，and their metabolic products in beer， barley tea， and their ingredients. Biosci. Biotechnol. Biochem， 2013， 77（11）： 2218-2221.

[2] Yul-Kyun Ahn， et al. Development of an Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation System and Production of Herbicide-Resistant Transgenic Plants in Garlic.Molecules and Cells， 2013， 36： 158-162.

[3] Ayalew Mentewab， et al.RNA-Seq Analysis of the Effect of Kanamycin and the ABC Transporter AtWBC19 on Arabidopsis thaliana Seedlings Reveals Changes in Metal Content. PLOS ONE， 2014， 9（10）： e109310.

[4] Srinath？Tamirisa， et al.Overexpression of pigeonpea stress-induced cold and drought regulatory gene （CcCDR） confers drought， salt， and cold tolerance in Arabidopsis.Journal of Experimental Botany， 2014， 65（17）： 4769-4781.

[5] Xie Z， Sundstr？m JF， Jin Y， et al. A selection strategy in plant transformation based on antisense oligodeoxynucleotide inhibition. Plant J， 2014， 77（6）： 954-961.

[6] Zhang H， Li J. From Cytosol to the Apoplast： The Hygromycin Phosphotransferase （HYG（R）） Model in Arabidopsis. Methods Mol Biol， 2016， 1459： 81-90.