何佩珊，馮興中，姜 敏，潘國鳳，楊公博，楊 萌，齊 慧

癌性疼痛是晚期腫瘤最常見的癥狀之一[1]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。前期研究顯示，芳香類中藥外敷能降低骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠機(jī)械性痛覺和熱刺激痛覺[3-4]。本研究應(yīng)用活體熒光成像肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛模型，探討芳香類中藥外敷緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的機(jī)制，為進(jìn)一步研究其機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及細(xì)胞株 SPF級雌性BALB/c-nu小鼠共40只，4周齡，體質(zhì)量（18±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK（京）2014-0004。轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的人肺腺癌A549細(xì)胞株，由安泰康生物技術(shù)（北京）有限公司提供。

1.2 藥物 香辛方以丁香、細(xì)辛（1∶2）研磨成粉調(diào)勻，加入透皮吸收劑薄荷醇，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑室制作。扶他林乳膏劑1% 20 g，國藥準(zhǔn)字H19990291，北京諾華制藥有限公司。

1.3 主要試劑及儀器 75%乙醇（批號11151107），山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號p3761），Sigma公司。注射器（批號329461），美國BD公司；FluorVivo-Model-100熒光成像儀，美國INDEC BioSystems公司；奧豪斯電子精密天平，美國OHAUS公司（型號CP323C）；醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)，日本奧林巴斯株式會社；倒置顯微鏡，日本NIKON株式會社（型號 MA100）。

1.4 小鼠骨轉(zhuǎn)移癌痛活體熒光成像模型建立 參考文獻(xiàn)[5]方法，裸鼠麻醉(戊巴比妥鈉麻醉)后，仰臥，腹部朝上，用75%乙醇消毒股骨處皮膚。膝關(guān)節(jié)處與股骨垂直方向切一長0.3～0.5 cm的皮膚切口，小心暴露髕骨。先用一次性無菌1 mL注射器針頭在髕骨沿股骨長軸方向穿刺打孔，然后換上30 μL注射器進(jìn)入股骨骨髓腔，緩慢注入50 μL表達(dá)綠色熒光蛋白的人肺腺癌A549細(xì)胞（1×106/mL）至股骨。注射完畢，用骨蠟封住針孔（圖1）。無菌棉簽蘸生理鹽水清洗創(chuàng)口，皮膚縫合。建模后第3 d，以FluorVivo-Model-100熒光成像儀對所有小鼠進(jìn)行全身成像（圖2）。假手術(shù)組在股骨注入等體積的生理鹽水，其余操作同上。造模第7 d，小鼠縮足反應(yīng)增多，表明癌痛模型造模成功[3]。

圖1 小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛造模照片

圖2 骨轉(zhuǎn)移癌痛模型熒光顯像圖

1.5 分組與給藥 將造模成功的30只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥外敷組、扶他林組、模型組，每組10只；另設(shè)假手術(shù)組10只。中藥外敷組給予香辛方0.5 g/(kg·d)，于術(shù)后7～21 d相同時(shí)間（9：00）外敷。于手術(shù)切口旁開約0.2 cm局部貼敷，至少持續(xù)6 h，1次/d。扶他林組（標(biāo)準(zhǔn)對照組）給予扶他林局部用藥0.1 g/(kg·d)，于相同時(shí)間進(jìn)行局部涂抹，1次/d。模型組（一般對照組）和假手術(shù)組（無腫瘤負(fù)荷）給予涂擦生理鹽水0.5 mL/只，1次/d。

1.6 觀察指標(biāo)及方法 采集標(biāo)本進(jìn)行指標(biāo)測定。造模21 d后，麻醉處死小鼠，在冰上剝離出小鼠腰椎（L3～L5）脊髓，迅速放入液氮中保存。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）檢測實(shí)驗(yàn)小鼠血漿（或血清）白介素-lβ（interleukin lβ，IL-lβ）、白介素 -6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子 α（tumour necrosis factor α, TNFα）及脊髓組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，后采用SNK進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腰椎脊髓MCP-1的表達(dá) 經(jīng)SNK法多重比較顯示，各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組脊髓MCP-1表達(dá)比假手術(shù)組升高（P＜0.01），提示骨癌痛小鼠出現(xiàn)了痛覺中樞敏化。中藥外敷組脊髓MCP-1的表達(dá)比模型組和扶他林組降低（P＜0.01）。見表1 。

表1 各組小鼠腰椎脊髓MCP-1的表達(dá)比較

2.2 血IL-1β水平 經(jīng)SNK法多重比較顯示，IL-1β水平扶他林組和模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中藥外敷組和假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。扶他林組和模型組IL-1β水平比假手術(shù)組高（P＜0.05）。中藥外敷組IL-1β水平比模型組和扶他林低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血IL-1β水平比較

2.3 血TNFα水平 經(jīng)SNK法多重比較顯示，TNFα水平扶他林組和模型組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥外敷組、扶他林組和模型組TNFα水平均比假手術(shù)組高（P＜0.05）。提示肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠血TNFα水平升高。中藥外敷組TNFα水平比模型組和扶他林組低（均P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血TNFa水平比較

2.4 血IL-6水平 經(jīng)方差分析，各組小鼠IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表4 各組小鼠血IL-6水平比較

3 討論

骨轉(zhuǎn)移癌痛成因復(fù)雜，造成骨質(zhì)破壞、骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫、高鈣血癥等，是晚期骨轉(zhuǎn)移患者最痛苦的癥狀之一。骨轉(zhuǎn)移癌屬中醫(yī)文獻(xiàn)中“骨瘤”、“骨蝕”、“骨疽”、“骨痹”等范疇，《清代外科證治全書》又有“貼骨瘤，貼骨而生，極疼痛”記載。目前中醫(yī)治療多以補(bǔ)腎、活血為主[6]。中藥外治法為體表直接給藥，藥力直達(dá)病所，止痛迅速有效，且可避免藥物內(nèi)服帶來的某些副作用。因此，中藥外治骨癌痛更具優(yōu)勢。吳師機(jī)《理瀹駢文》云：“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥，即內(nèi)治之藥，所異者法耳。醫(yī)理藥性無二，而法則神奇變化?！睆埦霸涝凇毒霸廊珪るs證謨·積聚》中云：“凡堅(jiān)硬之積，必在腸胃之外，募原之間，原非藥力所能卒至。宜用阿魏膏、琥珀膏，或水紅花膏、三圣膏之類，以攻其外。再用長桑君針法，以攻其內(nèi)”。對于癌性疼痛的病因，首先表現(xiàn)為局部的占位，阻滯經(jīng)絡(luò)氣血的實(shí)性疼痛，因?qū)嵵峦?。芳香類中藥具有走竄定痛的作用，同時(shí)其揮發(fā)油能促進(jìn)其他藥物透皮吸收，因此在疾病外治中應(yīng)用廣泛。

研究表明，骨癌所觸發(fā)的初級感覺神經(jīng)元的興奮性變化，以及脊髓神經(jīng)化學(xué)變化、細(xì)胞重塑是構(gòu)成其行為痛過敏的物質(zhì)基礎(chǔ)。骨癌導(dǎo)致初級感覺神經(jīng)元興奮性異常增加的因素來自兩個(gè)方面：一是破骨細(xì)胞的過度激活；二是腫瘤細(xì)胞分泌TNFα、IL-1、內(nèi)皮素-1等因子。另外腫瘤組織中有20%～30%的巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生TNFα和IL-1等，二者也均能興奮初級傳入神經(jīng)元[7-8]。而且骨癌痛動物初級傳入神經(jīng)元受到敏化與骨質(zhì)破壞程度、腫瘤生長相關(guān)。OPG/RANK/RANKL通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和生存的關(guān)鍵途徑。在惡性腫瘤的早期階段，患者骨髓中即可分離出播散腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cells，DTCs）[9-10]。DTCs可分泌IL-1、IL-6、MIP1a激活破骨細(xì)胞的生成，這些因子與前體破骨細(xì)胞表面的核因子κB的受體激活劑（receptor activator of NF-κB，RANK）相互作用可活化下游的許多細(xì)胞間的信號通路：NF-κB（nuclear factor-kappa B）、JUN 激酶及CaN/NFAT信號傳導(dǎo)通路，這些信號途徑的激活促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成、成熟和存活。除了促進(jìn)新生的破骨細(xì)胞形成，DTCs還可與骨髓中其他細(xì)胞相互作用，加強(qiáng)已存在的破骨細(xì)胞中的溶骨性骨吸收作用。DTCs分泌的前列腺素（prostaglandins）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormonerelated peptide，PTHrP）、 活 化 的 維 生 素 D、IL-6及TNFα可上調(diào)成骨細(xì)胞及骨基質(zhì)細(xì)胞表面的RANKL表達(dá)[11]。Miossec等[12]研究表明：普遍存在于骨髓中的T細(xì)胞也可分泌激活破骨作用的因子。DTCs分泌的IL-6、IL-1及 TGF-β可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，該細(xì)胞可通過分泌IL-17促進(jìn)破骨作用并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表面RANKL的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，肺癌骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠可見血IL-1β、TNFα水平升高。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，芳香類中藥外敷不僅促進(jìn)藥物透皮吸收，緩解患者骨轉(zhuǎn)移癌痛[13]。骨癌痛小鼠模型造模成功后第21 d，中藥外敷組小鼠縮足反應(yīng)百分率（23.10±3.38）%比扶他林組（32.70±4.45）%和模型組（52.20±5.61）%少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥外敷組熱刺激過敏為（14.10±3.68）s，比扶他林組（10.70±3.23）s和模型組（6.90±2.64）s延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明芳香類中藥外敷降低骨轉(zhuǎn)移癌痛小鼠機(jī)械性痛覺和熱刺激痛覺[4]；另外還對骨轉(zhuǎn)移瘤有一定的抑制作用[5]。香辛方可以降低血IL-1β水平和TNFα水平，可能通過下調(diào)炎性介質(zhì)表達(dá)起到緩解骨轉(zhuǎn)移癌痛的作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，丁香（油）可明顯提高小鼠機(jī)械性壓痛痛閾值[14]。其有效成分丁香苷對小鼠熱板試驗(yàn)、醋酸扭體試驗(yàn)有一定鎮(zhèn)痛作用[15]。細(xì)辛對抗炎、鎮(zhèn)痛具有明確作用[16]，對多種疼痛動物模型具有良好的鎮(zhèn)痛作用。與嗎啡比較，其鎮(zhèn)痛作用起效慢, 但作用時(shí)間長[17]。目前，中醫(yī)外治癌痛的常見機(jī)制有，抑制炎性介質(zhì)，抑制破骨細(xì)胞活化，抑制脊髓初級感覺神經(jīng)元活化，抑制中樞敏化，抑制離子通道等。腫瘤組織及周圍的炎性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，可分泌不同類型的炎性介質(zhì)，包括TNFa、內(nèi)皮素-1、IL-1和IL-6等，通過各自的受體，直接或間接致敏初級傳入神經(jīng)元[18]。骨內(nèi)和周圍的初級傳入神經(jīng)元含有獨(dú)特的蛋白，協(xié)助骨癌痛相關(guān)的溫度，機(jī)械性或化學(xué)刺激的傳導(dǎo)[19]。同時(shí)，還涉及其他間接機(jī)制，如腫瘤相關(guān)免疫調(diào)節(jié)，骨細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中釋放的介質(zhì)誘導(dǎo)溫度、機(jī)械和化學(xué)刺激，隨后引起疼痛感受器的激活。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，骨癌痛模型小鼠脊髓MCP-1的表達(dá)上調(diào)，提示骨癌痛小鼠出現(xiàn)了痛覺中樞敏化，這與以往的研究結(jié)果一致。中藥外敷方可以使脊髓MCP-1表達(dá)下降，抑制中樞敏化而起到止痛作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理痛大鼠模型上，背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角的磷酸化蛋白質(zhì)激酶B陽性神經(jīng)元顯著增加[20-21]。金迪等[22]對骨癌痛大鼠鞘內(nèi)給予MCP-1中和抗體后，脊髓p-Akt表達(dá)降低，并使機(jī)械痛閾明顯降低，說明脊髓MCP-1可能通過激活PI3K/Akt信號通路參與了大鼠骨癌痛的形成。骨轉(zhuǎn)移癌痛是機(jī)制復(fù)雜的慢性疼痛，中藥復(fù)方對骨癌痛的鎮(zhèn)痛也是從多環(huán)節(jié)、多因素來發(fā)揮作用的。本方對腫瘤生成的其他分子機(jī)制是否仍有抑制作用，我們將在下一步的課題研究中繼續(xù)深入研究。