王德強，余劍波，闞永星，宮麗榮

肢體缺血再灌注是血管嚴重創(chuàng)傷、骨科手術(shù)及栓塞性血管病常見的病理生理過程，再灌注誘發(fā)的氧化應(yīng)激不僅引起肢體局部的進一步損傷，更可導(dǎo)致遠隔臟器損傷，其中肺臟是最易受累的器官[1-2]。前期研究表明，電針刺可減輕肢體缺血再灌注誘發(fā)的肺損傷[3]，但具體作用機制不明確。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，其可調(diào)控血紅素氧合酶-1（HO-1）的表達，從而發(fā)揮抗氧化作用[4-5]。研究表明，Nrf2/HO-1信號通路參與了肢體缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的過程[6]。本文探討Nrf2/HO-1信號通路在電針減輕肢體缺血再灌注誘發(fā)兔肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物倫理委員會批準。健康清潔級新西蘭大白兔40只，雄性，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，3月齡，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供。G6805-1A低頻電子脈沖治療儀（上海華誼醫(yī)用儀器有限公司）；Nrf2抑制劑全反式維甲酸（Sigma公司，美國）；戊巴比妥納（百奧萊博公司）；Nrf2、HO-1兔多克隆抗體（Abcam公司，美國）；β-actin一抗、DAB顯色試盒（Santa Cruz公司，美國）；山羊抗兔IgG二抗（北京康為世紀生物科技有限公司）；SOD活性測定試劑盒及MDA含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 分組和模型制作 根據(jù)預(yù)實驗，選取40只新西蘭大白兔采用隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針組和全反式維甲酸組（n=10）。參照文獻[7]的方法建立肢體缺血再灌注模型。戊巴比妥納30 mg/kg腹腔注射麻醉后仰臥位固定于特制兔臺，右頸內(nèi)靜脈穿刺置管以備輸液。于兔雙后肢股動脈三角區(qū)備皮、消毒并切開，分離出股靜脈、股動脈后用微型動脈夾在近腹股溝韌帶處夾閉股動脈3 h形成缺血期，松開無創(chuàng)微動脈夾后再灌注4 h形成再灌注期。假手術(shù)組只放置微型動脈夾而不夾閉股動脈。全反式維甲酸組于模型制備前30 min腹腔注射Nrf2抑制劑全反式維甲酸7 mg/kg。實驗期間持續(xù)靜脈輸注生理鹽水1.5 mL ·kg-1·h-1。

1.3 電針刺預(yù)處理 參照中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，選取兔雙側(cè)足三里穴（后肢背外側(cè)，脛骨粗隆下部外約0.3 cm處）和肺俞穴（背部第3胸椎棘突下旁開約1.5 cm處）。采用特殊兔盒暴露針刺部位，局部消毒后，采用直徑0.3 mm一次性無菌針灸針直刺進針約4～6 mm接G6805-1A低頻電子脈沖治療儀進行刺激。針刺參數(shù)設(shè)置：頻率2/15 Hz，刺激電流l～2 mA，疏密波，以兔出現(xiàn)輕微肌顫為宜，每次持續(xù)30 min，1次/d。電針組及全反式維甲酸組于模型制備前1～4 d及模型制備過程中給與電針刺激。

1.4 標本采集 再灌注4 h時采用頸總動脈放血法處死兔，留取雙肺組織。取右肺上葉組織測定W/D比值，取部分左肺組織用10%多聚甲醛固定，取部分左肺組織經(jīng)液氮速凍處理后凍存于-80 ℃冰箱。

1.5 肺組織W/D比值的測定 取右肺上葉部分組織，紗布拭去水漬，置于精細天平上稱濕重（W），然后置于80 ℃電熱恒溫干燥箱烘干至恒重后稱干重（D），計算肺組織W/D比值。

1.6 肺損傷評分 左肺上葉組織置于10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片（4 μm），HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)結(jié)果。參照文獻[8]的方法進行肺損傷評分，取其平均值作為總體的肺組織損傷評分。

1.7 肺組織SOD活性和MDA含量的測定取-80℃凍存肺組織制備10%組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，所有步驟嚴格按照試劑盒操作步驟進行測定。

1.8 Western blotting法檢測肺組織Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白及HO-l蛋白表達 取-80 ℃凍存肺組織，按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白及核蛋白，10 000 g離心15 min后取上清液按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取樣品10 μg蛋白經(jīng)凝膠恒壓電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h后加入一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶3000）室溫孵育1 h后漂洗。TBST漂洗后于暗室中進行顯色和曝光，采用Quantity One圖像分析軟件進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶積分光密度值的比值反映Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白及HO-l蛋白表達水平。1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ ）表示，采用雙側(cè)檢驗，通過Ryan-Joiner法行正態(tài)性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。選取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化 檢測結(jié)果顯示（見圖1、表1），灌注4 h時，假手術(shù)組兔肺組織未見明顯病理改變，模型組、電針組及全反式維甲酸組可見不同程度肺泡或間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤、可見出血，電針組水腫、炎細胞浸潤和出血均較模型組減輕。模型組、電針組及全反式維甲酸組的肺損傷評分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組的肺損傷評分明顯低于模型（P＜0.05），全反式維甲酸組的肺損傷評分明顯高于電針組（P＜0.05）。

圖1 各組兔肺組織理表現(xiàn) （HE×100）

2.2 肺組織W/D比值的變化 測定結(jié)果顯示（見表1），灌注4 h時，模型組、電針組及全反式維甲酸組的W/D比值明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組的W/D比值明顯低于模型 （P＜0.05），全反式維甲酸組的W/D比值明顯高于電針組（P＜0.05）。

2.3 肺組織SOD活性和MDA含量變化 結(jié)果顯示，灌注4 h時，與假手術(shù)組比較，模型組、電針組及全反式維甲酸組的MDA含量明顯升高、SOD活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組MDA含量明顯降低、SOD活性明顯升高（P＜0.05）；與電針組比較，全反式維甲酸組明顯升高、SOD活性明顯降低（P＜0.05）。見表1.

表1 各組兔肺損傷評分、W/D比值、MDA含量及SOD活性的比較

2.4 肺組織Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白變化Western blotting結(jié)果顯示，灌注4 h時，模型組、電針組及全反式維甲酸組的Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白表達明顯高于假手術(shù)組 （P＜0.05），電針組的Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05），全反式維甲酸組的Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白表達明顯低于電針組，（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組肺組織Nrf2核蛋白、Nrf2總蛋白表達的變化

2.5 肺組織HO-l蛋白變化 Western blotting結(jié)果顯示，灌注4 h時，模型組、電針組及全反式維甲酸組的HO-l蛋白表達明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），電針組的HO-l蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05），全反式維甲酸組的HO-l蛋白表達明顯低于電針組，（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖3 各組HO-l蛋白表達的變化

肢體缺血再灌注引起遠隔肺損傷發(fā)病機制復(fù)雜, 其中再灌注引起的氧自由基和活性氧大量產(chǎn)生所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷已被認為是肢體缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的重要機制[1,9]。肺臟是富含脂質(zhì)的器官，很容易受到積蓄氧自由基的攻擊造成脂質(zhì)過氧化，從而引起細胞損傷。MDA為脂質(zhì)、蛋白質(zhì)過氧化過程中的產(chǎn)物，其高低可反映氧自由基對細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷程度。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化蛋白酶，可去除機體生物氧化產(chǎn)生的氧自由基，MDA和SOD均可特異性反映氧化應(yīng)激損傷程度[10-11]。本研究顯示，兔肢體缺血3 h 再灌注4 h后，肺組織W/D、肺損傷評分及MDA含量升高，而SOD活性降低。證實了氧化應(yīng)激反應(yīng)參與肢體缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的過程。

Nrf2是Ⅱ相解毒酶的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap-l）結(jié)合定位于細胞質(zhì)，其活性處于相對抑制狀態(tài)；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活性氧或親電子化合物的積聚使Nrf2從胞漿蛋白Keap-1中解離，易位至細胞核與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)SOD、HO-l、過氧化氫酶等抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達，而對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[4,12]。HO-l是催化血紅素降解為一氧化碳、膽紅素和游離鐵的關(guān)鍵酶和限速酶，在幾乎所有哺乳動物中均可表達，被認為是一種內(nèi)源性保護的早期應(yīng)激酶，在多種刺激因素引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)下表達增加，通過抗氧化損傷、抗炎性反應(yīng)或抗細胞凋亡等多重機制在多種生理病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[13-14]。研究表明，肢體缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的過程中，Nrf2/HO-1信號通路被激活，減輕肺損傷的發(fā)生[6]。

電針刺激具有雙向調(diào)節(jié)作用，可通過減少氧自由基產(chǎn)生、抗氧化應(yīng)激對臟器起保護作用[15-16]。足三里屬于足陽明胃經(jīng)穴，肺俞穴屬于足太陽膀胱經(jīng)穴。研究表明，電針刺足三里和肺俞穴位能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷，其機制可能與其抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)的作用有關(guān)[17]。本研究于肢體缺血再灌注模型制備前進行電針刺預(yù)處理并參照文獻[18]方法給予Nrf2抑制劑全反式維甲酸7 mg/kg。結(jié)果表明，電針刺足三里和肺俞穴可上調(diào)兔肺組織Nrf2總蛋白、Nrf2核蛋白及HO-l蛋白的表達，并降低MDA含量、增強SOD活性，減輕兔肺損傷；而Nrf2抑制劑全反式維甲酸可部分拮抗電針刺的這種肺保護作用。綜合研究結(jié)果，可能提示Nrf2/HO-1信號通路的激活，從而增強機體抗氧化損傷能力參與了電針減輕肢體缺血再灌注誘發(fā)兔肺損傷的過程，其它可能涉及的機制及調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路的上游機制待研究。