車娟娟，甄洪超，王 婧，李卉惠，曹邦偉

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，其五年生存率僅為15.9%[1]。按照病理學(xué)類型可分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），肺鱗癌和肺腺癌是NSCLC的主要病理類型，其中肺腺癌的發(fā)病率逐年升高，盡管近幾年肺腺癌的診療手段不斷進(jìn)步，但大多數(shù)肺腺癌患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，治療效果不佳，預(yù)后較差。因此，探索發(fā)現(xiàn)影響肺腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物非常重要。

DLG5是膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族的新成員[2]，DLG5是一種多功能調(diào)節(jié)和支架蛋白，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，包括β-catenin、p55、KIF20A、突觸結(jié)合蛋白4和枸櫞酸激酶[2-5]。DLG5在肺葉正常發(fā)育和肺泡祖細(xì)胞分化中起重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)DLG5在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，包括肝癌、前列腺癌、胰腺癌和膀胱癌[2-4,6]。研究發(fā)現(xiàn)DLG5可以抑制腎上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[5,7]。目前DLG5在肺腺癌中的研究非常少。

本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測122例肺腺癌組織中DLG5的表達(dá)情況，并運(yùn)用Western blotting法檢測20對肺腺癌和癌旁正常肺組織中DLG5的表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)因素分析和預(yù)后分析，探討DLG5在肺腺癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例收集：收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院2008年1月—2012年1月手術(shù)切除的肺腺癌石蠟包埋標(biāo)本122例，請高年資的病理醫(yī)師復(fù)習(xí)病理切片。

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前行胸部CT掃描、腦CT或MR掃描、腹部CT掃描，排除肝、全腦、雙側(cè)腎上腺、對側(cè)肺內(nèi)無轉(zhuǎn)移，全身ECT骨掃描檢查（部分患者行PET-CT檢查）排除骨轉(zhuǎn)移的患者；（2）術(shù)前未接受任何放、化療等抗癌治療；（3）依據(jù)NCCN指南要求，行肺癌根治性切除術(shù)及隨訪資料完整患者為研究對象，排除術(shù)后1月內(nèi)死亡病例。

治療方式：所有患者均經(jīng)手術(shù)治療，并且給予患者手術(shù)為主的綜合治療，ⅢA期患者術(shù)后予以輔助化療，部分ⅢA期患者行輔助放療。其中化療采用NSCLC的常規(guī)方案，包括培美曲塞聯(lián)合順鉑或卡鉑（PP）、紫杉醇聯(lián)合順鉑或卡鉑（TP）、多西他賽聯(lián)合順鉑或卡鉑（TP）。

1.2 免疫組化檢測方法 采用免疫組化SP法對所有標(biāo)本中的DLG5蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，具體方法：4 μm厚的組織切片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇入水。應(yīng)用3%的H2O2避光室溫放置20 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，使用0.1%枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）高溫高壓修復(fù)抗原后，滴加10%正常山羊血清反應(yīng)20 min，加DLG 5一抗（1:100稀釋，Assay Biotech，Sunnyvale，CA，USA），4 ℃過夜后，加入生物素標(biāo)記的二抗，在37 ℃孵育30 min，二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。封固后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。以前列腺癌組織染色結(jié)果作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。進(jìn)行免疫組化染色的標(biāo)本選取病理切片中整個視野均為腫瘤細(xì)胞且細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的區(qū)域。

免疫組化著色結(jié)果判斷DLG5陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜。免疫組化反應(yīng)根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比分級為0～3級。0 分：沒有著色或者陽性細(xì)胞小于10%；1分：大于10%的腫瘤細(xì)胞淺著色或者10%～40%的細(xì)胞中等著色；2分：大于40%的腫瘤細(xì)胞中等著色或者10%～40%的腫瘤細(xì)胞強(qiáng)著色；3分：大于40%的細(xì)胞強(qiáng)著色。為了便于統(tǒng)計分析，將0～1分者定義為陰性組，將2～3分者定義為陽性組。

1.3 Western blotting檢測方法 取出-80 ℃凍存的組織標(biāo)本，切取綠豆粒大小的組織標(biāo)本（肺腺癌組織和癌旁肺組織）；將要提取總蛋白的組織標(biāo)本利用液氮、研缽粉碎呈粉末狀后后移入1.5 mL的EP管中，加入RIPA裂解液，提取組織總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h后，加入DLG5（1:1000 dilution，Abcam，Cambridge，MA，USA）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次8 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次8 min，然后ECL顯影。

1.4 統(tǒng)計方法及隨訪 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，率的檢驗采用χ2檢驗，Kaplan-Meier法計算生存率，Log-rank檢驗進(jìn)行單因素分析，多因素分析利用Cox回歸模型進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。生存時間定義為：自手術(shù)治療之日至末次隨訪日或死亡的時間，以年為單位計算。失訪或隨訪截止時仍存活者視為截尾數(shù)據(jù)，隨訪終止日期為2017年1月1日。

2 結(jié)果

2.1 DLG5在肺腺癌中的表達(dá)情況及與臨床特征的關(guān)系 免疫組化法檢測DLG5表達(dá)如圖1，DLG5陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜上。122例肺腺癌的基本臨床病理特征如表1。分析122例患者中，DLG5表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、T分期無相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.003）、TNM分期（P=0.003）及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（P=0.000）相關(guān)，結(jié)果如表2所示。I期肺腺癌患者DLG5陽性表達(dá)率明顯高于ⅢA期患者。

圖1 免疫組化檢測DLG5在肺腺癌組織表達(dá)情況

表1 肺腺癌患者臨床病理資料情況

表2 122例肺腺癌標(biāo)本中DLG5陽性表達(dá)與臨床因素的關(guān)系

2.2 DLG5在肺腺癌和癌旁肺組織中的表達(dá)情況 運(yùn)用Western blotting方法隨機(jī)檢測20對肺腺癌和癌旁組織中DLG5的表達(dá)情況，并進(jìn)行三次實驗重復(fù)驗證，結(jié)果顯示DLG5在肺腺癌中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織（T代表腫瘤，N代表癌旁組織），隨機(jī)選取其中四對標(biāo)本的結(jié)果如圖2（灰度值標(biāo)識于圖2）所示。

圖2 Western blot檢測肺腺癌和癌旁組織中DLG5的表達(dá)情況

2.3 DLG5在肺腺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系 患者總體中位生存期為51.0個月，95%CI（34.526，67.474），1、2和5年生存率分別為83.6%、65.5%和43.9%。DLG5表達(dá)陰性的患者，中位生存期明顯短于表達(dá)陽性的患者（20.0個月vs 67.0個月），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.522，P=0.004)。

2.4 患者生存的預(yù)后因素分析 應(yīng)用Kaplan-Meier法對122例肺腺癌患者相關(guān)因素進(jìn)行單因素分析顯示：性別、年齡、吸煙史對患者生存率的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而DLG5、T分期及TNM分期對患者生存率的影響有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（如表3）。

表3 肺腺癌患者的預(yù)后因素的單因素分析結(jié)果

對上述進(jìn)行單因素分析的因素，包括年齡、性別、吸煙史、T分期、N分期、TNM分期以及DLG5的表達(dá)，納入Cox回歸模型，行多因素分析顯示：DLG5（P=0.000）和TNM分期（P=0.018）是肺腺癌獨(dú)立的預(yù)后影響因素，其生存曲線分別如圖3、圖4和表4所示。

圖3 肺腺癌患者中不同DLG5表達(dá)的生存曲線

圖4 不同TNM分期肺腺癌患者的生存曲線

表4 肺腺癌患者的預(yù)后因素的多因素分析結(jié)果

3 討論

盤狀大同源物5（DLG5）是膜相關(guān)鳥苷酸激酶（MAGUK）家族成員[2]。MAGUK蛋白包括催化失活鳥苷酸激酶結(jié)構(gòu)域，PDZ結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)構(gòu)域[2,8]，所有這些結(jié)構(gòu)域都與蛋白-蛋白間的相互作用相關(guān)，因此支持DLG5是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白和支架蛋白。Tomiyama等研究發(fā)現(xiàn)DLG5可以與Vixin蛋白相結(jié)合，并且發(fā)現(xiàn)DLG5可以與β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞膜共定位[9]。DLG5還可以與其他蛋白相結(jié)合，包括p55、KIF20A、syntaxin 4和檸檬酸激酶[2-4,6]。DLG5具有許多重要的生理作用，DLG5在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和維持上皮細(xì)胞極性方面發(fā)揮了重要作用[6,10,11]。基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)DLG5是維持細(xì)胞極性和細(xì)胞間粘附連接的必需蛋白[6]。DLG5參與構(gòu)成細(xì)胞的緊密連接，并且在哺乳動物大腦、腎臟[6]和肺[11]上皮細(xì)胞的極性維持中發(fā)揮了重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)DLG5可以通過減弱TGF-β[12-13]信號通路抑制腎上皮細(xì)胞和前列腺上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。在許多侵襲性強(qiáng)的惡性腫瘤中也檢測到DLG5表達(dá)下調(diào)[9-10,14-15]。Tomiyama等研究發(fā)現(xiàn)慢病毒敲除DLG5可以使前列腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)[9]。Smolen等研究發(fā)現(xiàn)高組織學(xué)分級和預(yù)后較差的乳腺癌組織DLG5表達(dá)下調(diào)，并且敲除DLG5可以誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞遷移[10]。本研究通過運(yùn)用免疫組化方法檢測了210例I期和IIIA期肺腺癌組織中DLG5的表達(dá)情況，DLG5表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。并且進(jìn)一步運(yùn)用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中DLG5的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織。這些研究結(jié)果提示我們DLG5可能作為一種抑癌因子發(fā)揮作用。

目前國內(nèi)外有關(guān)DLG5與腫瘤預(yù)后的相關(guān)研究較少，Ke等研究發(fā)現(xiàn)人肝細(xì)胞癌組織中DLG5的表達(dá)量明顯低于癌旁非腫瘤組織，并且肝細(xì)胞癌細(xì)胞中DLG5的表達(dá)量也明顯低于正常肝細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DLG5低表達(dá)與肝細(xì)胞癌較晚分期，較短總生存期（OS）和DFS（diseasefree survival）相關(guān)，體內(nèi)實驗結(jié)果表明，DLG5過表達(dá)可以顯著抑制肝細(xì)胞癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，DLG5可以作為HCC患者的預(yù)后預(yù)測因子[16]。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)與乳腺癌組織相比，DLG5在正常乳腺組織中的表達(dá)量明顯增加，DLG5在低級別乳腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于高級別腫瘤組織，在I期乳腺癌組織中的表達(dá)量高于II期，而II期高于III期。我們的研究結(jié)果顯示IIIA期肺腺癌組織中DLG5的陽性表達(dá)率明顯低于I期患者。DLG5表達(dá)陰性的患者，中位生存期明顯短于表達(dá)陽性的患者（20.0個月vs 67.0個月），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.522，P=0.004）。生存分析顯示DLG5是肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素。這些研究表明DLG5可能作為肺癌預(yù)后的預(yù)測因子。

我們的研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中DLG5的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁肺組織，DLG5與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，DLG5是肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素。同時我們的結(jié)果也顯示TNM分期也是影響非小細(xì)胞肺癌預(yù)后獨(dú)立的因素，隨著分期的推后，預(yù)后逐漸變差，因此合理精確的分期能夠指導(dǎo)術(shù)后恰當(dāng)?shù)木C合治療。目前隨著綜合治療手段的不斷提升，包括靶向治療、免疫治療，另外隨著整個人群健康意識的提高，生活方式的改變與調(diào)整，可能都會對非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后產(chǎn)生一定的影響。

許多研究進(jìn)一步探討了DLG5在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的可能機(jī)制。Ke等運(yùn)用基因敲除技術(shù)沉默正常人肝細(xì)胞HepG2 DLG5的表達(dá)后，促進(jìn)了HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT和偽足形成，并增強(qiáng)了偽足相關(guān)的侵襲能力[16]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)DLG5表達(dá)缺失可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為ZO1表達(dá)減低而Vimentin表達(dá)增加。并且DLG5表達(dá)缺失可以擾亂上皮細(xì)胞極性，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[17]。Tomiyame等研究發(fā)現(xiàn)DLG5可以與Girdin相互作用，抑制Girdin的活性，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移能力[9]。我們將進(jìn)一步探討DLG5對肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的可能機(jī)制。