崔紀(jì)芳，王宏磊，趙永捷，劉艷迪

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，以亞洲人群發(fā)病率最高，我國每年新發(fā)胃癌患者40萬例，約占世界總發(fā)病例數(shù)的42%[1]。胃癌病情隱匿，發(fā)現(xiàn)時往往已處于中晚期，治療方案有限且預(yù)后較差，對患者的身體健康及生命安全造成嚴(yán)重威脅。因此，尋找一個有效的分子標(biāo)記物來評價胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。

X染色體連鎖鋅指蛋白（zinc fi nger protein X-linked，ZFX）位于X染色體，屬于鋅指蛋白家族，ZFX在胚胎期和成年期的造血干細(xì)胞進(jìn)行自我更新過程中扮演轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的角色[2]。最新研究表明，ZFX在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，如乳腺癌、口腔癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、前列腺癌等[3-7]。然而ZFX表達(dá)與胃癌患者的臨床各項(xiàng)指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究檢測了胃癌及其癌旁組織中ZFX的表達(dá)情況，并探討其作為胃癌患者預(yù)后生物標(biāo)志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床材料 標(biāo)本取自天津市人民醫(yī)院普外科于2013年1月—2015年12月手術(shù)切除的胃癌樣本。其中收集新鮮的胃癌標(biāo)本及其癌旁對照標(biāo)本（據(jù)原發(fā)灶邊緣至少5 cm）各43例，置于RNA保護(hù)液中，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于qRT-PCR檢測。另收集手術(shù)切除胃癌石蠟標(biāo)本及其對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本各114例，用于IHC檢測。

收集患者臨床病理資料包括腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等?；颊吣挲g39～78歲，平均年齡（69.98±13.21）歲。其中男性88例，女性26例；胃底腫瘤60例，胃體23例，胃竇31例。腫瘤小于6 cm的76例，大于6 cm的38例。根據(jù)組織分化分類，其中高/中分化33例，低/未分化81例。根據(jù)浸潤深度分類，T1/T2者48例，T3/T4者66例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)分期，I～I(xiàn)I期45例，III期69例。所有腫瘤組織均經(jīng)病理證實(shí)為胃癌，組織類型均為腺癌。所有患者均未接受術(shù)前化療和放療。

對所有胃癌患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，每三個月通過電話或問卷調(diào)查的方式進(jìn)行一次隨訪，并將所得臨床參數(shù)記錄在數(shù)據(jù)庫中。隨訪起點(diǎn)為病理確診日期，末次隨訪時間為2018年8月31日。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購自北京天根，引物購自上海生工，ZFX單克隆抗體購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物標(biāo)記二抗、DAB顯色試劑盒購置北京中杉金橋。實(shí)時熒光定量PCR儀為illumina Ero，光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS。

1.2.2 胃癌和癌旁組織中ZFX mRNA的表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR的方法。依據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取組織中的總RNA。測量濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明合成cDNA。然后以該cDNA為模板，qRT-PCR檢測評估ZFX mRNA的表達(dá)程度。反應(yīng)過程：95 ℃ 3 min，隨后95 ℃ 6 s、40 個循環(huán)，60 ℃ 35 s。通過 RQ=2-ΔΔCt方式計(jì)算。ZFX及內(nèi)參照GAPDH 引物序列見表1。進(jìn)行三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

表1 ZFX及GAPDH引物序列

1.2.3 胃癌和癌旁組織中ZFX 蛋白的表達(dá)水平分析 采用免疫組化的方法。樣本均切成4微米厚的切片，常規(guī)脫蠟后梯度乙醇水化；檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加ZFX一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBS緩沖液洗滌后，滴加二抗，37 ℃孵育30 min。最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。ZFX陽性切片可見細(xì)胞胞核呈棕黃色，部分病例可見胞漿著色。染色結(jié)果由細(xì)胞的染色百分比表示（0～100%）。細(xì)胞染色百分比0～10%為陰性表達(dá)，10～20%為中等表達(dá)，大于20%為強(qiáng)表達(dá)，其中中等表達(dá)與強(qiáng)表達(dá)都認(rèn)定為陽性表達(dá)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。ZFX組間表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)，評估ZFX表達(dá)與胃癌患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)。通過Kaplan-Meier分析來評價胃癌患者總生存率與陽性ZFX表達(dá)和陰性ZFX表達(dá)的關(guān)系。P＜0.05、P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZFX mRNA在胃癌及癌旁組織的表達(dá)比較 如表2和圖1 所示，ZFX mRNA在胃癌組織中的相對表達(dá)量為6.36±2.30，而相應(yīng)癌旁組織僅為1.50±0.88，胃癌組織明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 ZFX mRNA在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)量

圖1 ZFX mRNA在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)

2.2 ZFX 蛋白在胃癌及癌旁組織的表達(dá)比較 通過IHC檢測ZFX蛋白的表達(dá)，結(jié)果表示ZFX在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為76.3%，而在正常組織中僅為19.3%，胃癌組織中ZFX的表達(dá)水平顯著高于正常組織（P＜0.01），見表3，圖2。

表3 胃癌與癌旁組織中ZFX蛋白的表達(dá)情況

圖2 免疫組化法檢測ZFX蛋白在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)（SP, ×400）

2.3 ZFX表達(dá)與胃癌患者臨床指標(biāo)相關(guān)性 運(yùn)用卡方檢驗(yàn)評價ZFX蛋白表達(dá)與胃癌患者的臨床參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：ZFX表達(dá)與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的浸潤深度密切相關(guān)（P＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤部位及TNM分期無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表4。

2.4 ZFX與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)IHC檢測結(jié)果，將胃癌患者預(yù)后與ZFX表達(dá)水平進(jìn)行生存分析并繪制 Kaplan-Meier生存曲線，探討ZFX蛋白表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系，見圖3。結(jié)果顯示ZFX蛋白高表達(dá)胃癌患者的總生存期僅為38.68±2.74月，相較于ZFX蛋白低表達(dá)的胃癌患者的53.31±4.43月明顯偏低（χ2=3.944，P=0.047），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 ZFX表達(dá)與胃癌患者總生存率的關(guān)系

表4 ZFX表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

胃癌惡性程度高，早期癥狀不明顯且進(jìn)展迅速，發(fā)現(xiàn)時往往為時已晚。盡管胃癌的診治技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，但其預(yù)后仍不樂觀。最新調(diào)查證明，胃癌患病率呈明顯上升趨勢[1]。而單純依靠臨床和病理分期來評價胃癌患者的預(yù)后是不夠準(zhǔn)確的。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記物用來評價胃癌患者的預(yù)后。

鋅指蛋白（zinc fi nger protein）是一類含有短的穩(wěn)定的能與 Zn2+結(jié)合并自我折疊形成“手指”結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，他們廣泛分布于真核基因組并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。鋅指蛋白與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，如鋅指蛋白280B能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長，鋅指蛋白703促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[8-9]。X染色體連鎖鋅指蛋白（zinc fi nger protein，X-linked，ZFX）作為鋅指蛋白超家族中一員，在多種干細(xì)胞的自我更新和抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮作用[2]。近年的研究顯示ZFX在多種惡性腫瘤中如結(jié)腸癌、肝癌、骨肉瘤、白血病等中異常表達(dá)，并參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10-14]。ZFX 基因在膽囊癌中高表達(dá)，沉默 ZFX 的表達(dá)能夠顯著地抑制膽囊癌細(xì)胞的遷移[15]。在腎細(xì)胞癌中，ZFX 基因和蛋白的表達(dá)陽性率均明顯升高，且與腎癌的TNM分期、腫瘤大小等因素密切相關(guān)[5]。在本研究中，ZFX mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均高于相應(yīng)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ZFX在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促癌基因的作用。為了進(jìn)一步了解ZFX在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們探討了ZFX表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，ZFX表達(dá)與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的浸潤深度密切相關(guān)，與患者的年齡、性別、腫瘤部位及TNM分期無明顯相關(guān)性，提示ZFX的異常表達(dá)增高與胃癌的惡性程度、疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。結(jié)合既往的研究報(bào)道，ZFX有可能通過修改下游某些基因，如胱天蛋白酶1，蛋白激酶存活素和Ki-67的表達(dá)來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[16]；ZFX或作為轉(zhuǎn)錄活化因子通過結(jié)合CpG島啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與腫瘤發(fā)生；ZFX也可能通過調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)的多個重要信號通路通如ERK-MAPK、MAPK等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。但關(guān)于ZFX在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。進(jìn)一步的Kaplan-Meier生存分析顯示，ZFX陽性表達(dá)的胃癌患者的生存期明顯低于表達(dá)陰性的患者，提示ZFX表達(dá)可作為評價胃癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物之一。

綜上所述，ZFX在胃癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)合ZFX表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，提示ZFX蛋白可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，對于判斷胃癌的進(jìn)展及預(yù)后具有重要的價值。本研究結(jié)果有望為基于ZFX研究胃癌的預(yù)后判斷提供一點(diǎn)的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。