任曉靜，楊 濤，耿立成

缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）導(dǎo)致的腸損傷是創(chuàng)傷、膿毒癥及腹部大手術(shù)等的嚴(yán)重并發(fā)癥，是圍手術(shù)期重癥患者死亡的主要因素之一[1]。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腸黏膜細(xì)胞凋亡及緊密連接破壞在腸I/R損傷的發(fā)生及進(jìn)展中扮演重要的角色[2]。多項研究表明，黃芪甲苷（astragaloside IV, AS-IV）對I/R導(dǎo)致的腦、心肌、肝、肺等器官損傷均具有明確的保護(hù)作用[3-6]，然而AS-IV對I/R所致腸損傷的作用尚未見報道。本實驗研究擬通過建立大鼠腸I/R損傷的動物模型，探討AS-IV在調(diào)節(jié)腸I/R損傷中的治療保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年雄性SPF級、體質(zhì)量180～220 g的Wistar大鼠，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 主要藥物與試劑 AS-IV（批號170302）購自南京森貝伽生物科技有限公司；TNF-α、HMGB-1、SOD和CAT的ELISA試劑盒全部購自 美 國 R&D公 司。Bcl-2、Bax、Caspase-9及GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Roche公司，熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。小鼠抗occludin單克隆抗體、兔抗ZO-1單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 高速低溫離心機(jī)（日本Kubota公司）；ST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）；正置光學(xué)顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；熒光定量PCR儀（Thermo公司，美國）；SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)及全自動凝膠成像-分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)（Sham）組、模型（I/R）組、AS-IV預(yù)處理（AS-IV）組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，AS-IV組于造模前60 min時，使用濃度劑量為60 mg/kg的AS-IV對大鼠進(jìn)行灌胃預(yù)處理；Sham組和I/R組給予等體積的生理鹽水灌胃預(yù)處理。

1.2.2 模型制備 按照參照文獻(xiàn)[7]制備大鼠腸I/R損傷模型。大鼠于術(shù)前禁食12 h，自由飲水，按照300 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)給與大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定于動物手術(shù)臺。按照無菌操作原則，經(jīng)腹正中切口，尋找并分離腸系膜上動脈（superior mesenteric artery，SMA），無創(chuàng)微動脈夾夾閉SMA，觀察到SMA搏動消失且腸壁色澤變蒼白的同時開始腸缺血計時；缺血60 min后松開動脈夾，恢復(fù)血流灌注，肉眼可見腸系膜動脈搏動恢復(fù)，小腸組織顏色由暗紅變?yōu)轷r紅，表明再灌注成功。回納血管，關(guān)閉腹腔。其中，I/R組和AS-IV組按照上述方法建立模型，Sham組僅分離SMA而不夾閉。各組于再灌注120 min時，分別取血及小腸組織進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

1.2.3 炎癥因子及抗氧化酶的測定 于再灌注120 min時，大鼠心尖處穿刺采集血樣，4 ℃靜置30 min，4 ℃離心10 min（3×103轉(zhuǎn)/min，離心半徑10 cm），收集上清。運用ST-360酶標(biāo)儀，采用ELISA法檢測上清液中TNF-α、HMGB-1、SOD和CAT的水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 小腸組織染色及病理評分 血樣采集完畢后立即處死大鼠，取距離回盲瓣約5 cm處腸段1 cm，10%多聚甲醛固定。小腸組織常規(guī)石蠟包埋、切片后HE染色，光鏡下（×100）觀察小腸組織病理學(xué)變化情況，并行Chiu評分，隨機(jī)選取5個視野，取其平均值。

1.2.5 凋亡分子mRNA的測定 另取距回盲瓣6 cm處的腸段1 cm，放入勻漿器，加入TRIZOL溶液1 mL，多次研磨將組織磨成勻漿，使細(xì)胞完全裂解，提取小腸組織樣本中的總RNA，測定其含量和純度。運用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以總RNA 1 μg為模板，總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：25 ℃預(yù)熱10 min，55 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，85℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。所合成的cDNA置于-20 ℃條件下保存。Bcl-2、Bax、Caspase-9及 GAPDH引 物 由 上海生工生物工程有限公司合成。Bcl-2的上游引物：5’-GCTACGA GTGGGATACTGGAGA-3’，下游引物：5’-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3’，引物長度 371 bp。Bax的 上游引物：5’-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3’， 下游引物：5’-TGAGGAC TCCAGCCACAAA-3’，引物長度377 bp。Caspase-9的上游引物：5’-AGCCAGATGCTGTCCCATAC-3’， 下游引物：5’-CAG GAGACAAAACCTGGGAA-3’，引物長度593 bp。GAPDH的上游引物：5’-AACAGCAACTC CCACTCTTC-3’， 下游引物：5’-CCTCTCTTGCTCAGTGTCCT-3’， 產(chǎn) 物長度252 bp。運用熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環(huán)。應(yīng)用熒光定量PCR儀，運用2-△△CT法對Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA水平進(jìn)行相對定量分析。

1.2.6 緊密連接蛋白的測定 另取距回盲瓣7 cm處的腸段10 cm，充分勻漿裂解，4 ℃離心10 min（1×104r/min，離心半徑10 cm）。收集上清，BCA法測定蛋白濃度。于10% SDS-PAGE凝膠泳道中上樣電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入以下一抗：小鼠抗occludin單克隆抗體（稀釋度1:1000）、兔抗ZO-1單克隆抗體（稀釋度1:1000）和小鼠抗β-actin單克隆抗體（稀釋度1:2000），4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋度1:1000）室溫孵育2 h。洗膜后在暗室中加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，運用全自動凝膠成像-分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性信號檢測及分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析與處理 本研究所有數(shù)據(jù)運用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料先采用Shapiro-Wilk法檢驗判斷數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表示。組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS-IV預(yù)處理對大鼠小腸組織病理學(xué)變化的影響 與Sham組比較，I/R組的小腸組織病理學(xué)Chiu評分顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-IV組的小腸組織病理學(xué)Chiu評分顯著降低（P＜0.05），見圖 1、表 1。

表1 大鼠再灌注120 min時小腸組織Chiu評分

2.2 AS-IV預(yù)處理對大鼠炎癥因子和抗氧化酶的影響 與Sham組比較，I/R組TNF-α和HMGB-1的水平顯著升高，SOD和CAT的水平顯著降低（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-IV組TNF-α和HMGB-1的水平顯著降低，SOD和CAT的水平顯著升高（P＜0.05），見表2。

2.3 AS-IV預(yù)處理對大鼠小腸組織凋亡相關(guān)分子mRNA水平的影響 與Sham組比較，I/R組Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA水平顯著升高（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-IV組Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表2 三組大鼠再灌注120 min時，炎癥因子與抗氧化酶水平

表3 三組大鼠再灌注120 min時，凋亡相關(guān)分子mRNA水平

2.4 AS-IV預(yù)處理對大鼠小腸組織中occludin和ZO-1的表達(dá)水平的影響 與Sham組比較，I/R組occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與I/R組比較，AS-IV組occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表4。

圖2 三組大鼠再灌注120 min時，Western blotting法測定ZO-1和occludin蛋白表達(dá)情況

表4 三組大鼠再灌注120 min時，ZO-1和occludin蛋白表達(dá)水平（n=10，）

表4 三組大鼠再灌注120 min時，ZO-1和occludin蛋白表達(dá)水平（n=10，）

注：a與Sham組比較，P＜0.05；b與I/R組比較，P＜0.05

組別 n occludin ZO-1 Sham 組 10 1.082±0.131 0.891±0.068 I/R 組 10 0.235±0.037a 0.138±0.022a AS-IV 組 10 0.593±0.096b 0.635±0.054b

3 討論

腸I/R損傷是創(chuàng)傷、膿毒癥及腸移植、腹主動脈瘤等大手術(shù)的常見嚴(yán)重并發(fā)癥，較高的發(fā)病率與死亡率是此類重癥患者死亡的主要原因之一[1,8]。本研究通過分離并夾閉SMA 60 min后再灌注120 min建立腸I/R大鼠模型，研究黃芪甲苷預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注損傷的影響。

AS-IV是由黃芪中所提取出的一種高純度藥物成分。黃芪成分非常復(fù)雜，其主要活性成分為黃芪多糖，而后者的主要有效成分則為多糖和黃芪苷[9]。黃芪苷可分為三類：黃芪苷Ⅰ、黃芪苷Ⅱ、黃芪苷IV。其中，黃芪苷IV生物活性最佳，即AS-IV[10]。參考文獻(xiàn)報道[3-6]，本實驗選擇濃度劑量為60 mg/kg的AS-IV對大鼠進(jìn)行灌胃預(yù)處理，結(jié)果表明，腸I/R模型的小腸組織Chiu評分顯著升高，表明大鼠腸I/R損傷模型成功建立；而AS-IV預(yù)處理能夠顯著降低小腸組織的Chiu評分，證實該AS-IV預(yù)處理方案對腸I/R損傷具有確切的保護(hù)效應(yīng)。

多重傷害性因素，如大量氧自由基生成、炎性介質(zhì)過度釋放、腸上皮細(xì)胞異常凋亡、緊密連接破壞等因素均參與腸I/R損傷的發(fā)生與進(jìn)展過程。本研究首先通過測定炎性因子釋放水平從而反映炎癥反應(yīng)程度[2]。本研究結(jié)果表明，AS-IV預(yù)處理能夠有效減輕TNF-α與IL-1β水平的過度表達(dá)，提示AS-IV減輕腸I/R損傷的作用可能與抗炎作用有關(guān)。本研究進(jìn)一步通過測定抗氧化酶反映氧化應(yīng)激水平，通過測定凋亡相關(guān)分子的mRNA水平從而反映細(xì)胞凋亡程度，發(fā)現(xiàn)AS-IV預(yù)處理能夠顯著緩解腸I/R所致SOD和CAT的低表達(dá)，降低I/R所致的Bcl-2、Bax和Caspase-9的高mRNA表達(dá)，提示AS-IV對腸I/R損傷的保護(hù)作用可能與抗氧化、抗凋亡作用有關(guān)。

緊密連接位于腸道黏膜上皮細(xì)胞膜邊緣，使得腸上皮細(xì)胞彼此之間的間隙處于可控制的密封狀態(tài)，是腸屏障的重要組成部分[11]。ZO-1和occludin是緊密連接的主要成員，因此本研究通過測定上述兩種分子的蛋白表達(dá)水平，從而反映緊密連接的完整性。AS-IV預(yù)處理能夠顯著減輕腸I/R所致的ZO-1和occludin蛋白表達(dá)下調(diào)，提示AS-IV治療腸I/R損傷的作用可能與緩解緊密連接受損有關(guān)。

綜上所述，AS-IV灌胃預(yù)處理能夠顯著改善大鼠腸I/R損傷，其機(jī)制可能與減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平、抑制腸道細(xì)胞的凋亡發(fā)生以及調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)有關(guān)。