康 凱，陳小云*，張 敏，李偉杰，王鳳國，梁達(dá)雪，陳瑞愛

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.廣東大華農(nóng)動物保健品有限公司，廣東云浮527400)

雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)，多侵害20日齡以內(nèi)雛雞，引起雛雞急性敗血癥，日齡較大的雛雞可表現(xiàn)為白痢。其發(fā)病率和致死率較高，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對人類的健康也存在一定的威脅[1-2]。

根據(jù)沙門氏菌菌落特點(diǎn)，可將其分為光滑型和粗糙型，而兩者無血清學(xué)交叉反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的S.pullorum野毒株均為光滑型菌株，因此，篩選重組粗糙型S.pullorum作為研制疫苗用菌株，是雞白痢DIVA(區(qū)分感染動物與疫苗免疫動物)疫苗的理想候選株。

由rfaH基因編碼的RfaH蛋白是一種抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白[3-4]。在鼠傷寒沙門氏菌中，該蛋白可以影響LPS核心區(qū)和O抗原的表達(dá)[5]，而O鏈缺失會導(dǎo)致光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛汀Ｓ纱送茰y，去除S.pullorum rfaH基因可以將其變?yōu)榇植谛途?，并?shí)現(xiàn)減毒效果。本研究利用自殺質(zhì)粒的同源重組，敲除rfaH基因，獲得不含外源分子標(biāo)記及遺傳穩(wěn)定的粗糙型S.pullorum候選疫苗株。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、血清和實(shí)驗(yàn)動物 S.pullorum CVCC 79201株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存及鑒定；自殺質(zhì)粒pKNG101購自荷蘭微生物菌種保藏中心；抗S.pullorum陰、陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；伊莎褐蛋雞購自廣東省新興縣種雞場。

1.2 主要試劑和儀器 T4DNA連接酶、Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司；電轉(zhuǎn)化儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 引物 按照S.pullorum 287/91株(NC_011274)的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增沙門氏菌rfaH基因上、下游同源重組序列，以及rfaH基因缺失后的檢測引物(DrfaH-U/DrfaH-L)(表 1)。

表1 PCR引物序列Table 1Primers used to generate different fragments for the construction of homologous recombinant plasm ids

1.4 同源重組序列的克隆及重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書的方法，提取S.pullorum基因組DNA并擴(kuò)增上、下游同源重組序列：94℃ 5min；94℃ 40s、54℃ 40s、72℃1m in，31個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。XhoⅠ酶切后，克隆至pMD18-T載體中，篩選獲得重組質(zhì)粒pMD-rfaHUL，通過SalⅠ和ApaⅠ克隆至自殺質(zhì)粒pKNG101中，獲得用于同源重組的自殺質(zhì)粒pKNG-rfaHUL。將pKNG-rfaHUL分別用XhoⅠ、SalⅠ和ApaⅠ進(jìn)行酶切鑒定及序列測定。

1.5 S.pullorum rfaH基因的敲除 采用甘油方法制備感受態(tài)S.pullorum，并與pKNG-rfaHUL混勻電擊。加入預(yù)熱的普通肉湯培養(yǎng)基，37℃150r/min搖振培養(yǎng)2h后，將菌液涂布于含50μg/m L鏈霉素的普通瓊脂培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)24h。篩選抗性菌落，即為重組菌。增菌培養(yǎng)后，利用自殺質(zhì)粒帶有的SacB蔗糖敏感基因，在含5%蔗糖的LB平皿上，篩選耐蔗糖，即為rfaH基因缺失菌。

1.6 rfaH基因缺失S.pullorum的鑒定 挑取單個(gè)菌落，接種到普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16h，提取細(xì)菌基因組DNA。以DrfaH-U和DrfaH-L為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆至pMD18-T中測序(北京三博遠(yuǎn)志生物工程技術(shù)有限公司)。將陽性的重組菌命名為rSp。

對rSp分別進(jìn)行吖啶黃凝集試驗(yàn)、菌落結(jié)晶紫染色和沉降速度試驗(yàn)，同時(shí)以親本株CVCC79201株作為對照。

1.7 傳代穩(wěn)定性檢測 將rSp在培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)15代，以1.6中方法分別檢測rSp的缺失基因和粗糙型特性，確定其傳代穩(wěn)定性。

1.8 rSp抗原及抗血清的血清學(xué)反應(yīng)特性 用rSp和CVCC 79201制備抗原，分別與抗雞白痢陰、陽性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)；同時(shí)將rSp和親本株CVCC79201分別皮下免疫S.pullorum抗原和抗體陰性的伊莎褐蛋雞，2周后分離rSp和親本株CVCC 79201抗血清，分別與雞白痢雞傷寒多價(jià)染色平板抗原進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，確定rSp抗原及抗血清的反應(yīng)特性。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組自殺質(zhì)粒的鑒定 將篩選獲得的重組自殺質(zhì)粒pKNG-rfaHUL分別用XhoⅠ、SalⅠ和ApaⅠ進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期一致。測序結(jié)果表明，rfaH基因上、下游同源重組序列正確插入自殺質(zhì)粒pKNG101中，并且序列正確。

2.2 重組效率鑒定 感受態(tài)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，濃度為1.7×109cfu/m L；2.5μg pKNG-rfaHUL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化50μL CVCC79201感受態(tài)細(xì)胞24h后，由鏈霉素普通瓊脂平皿上獲得9個(gè)菌落，排除因電擊死亡的細(xì)菌，重組率約為5.3×10-9。

2.3 重組菌的PCR鑒定 以DrfaH-U和DrfaH-L為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以親本株CVCC 79201基因組DNA作為對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳(圖1)和序列測定，結(jié)果均與預(yù)期一致，即重組菌因缺失rfaH基因，PCR產(chǎn)物大小約為336bp，而以親本株CVCC79201基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物中，包含了完整的rfaH基因，大小約為835bp。

2.4 基因缺失菌株的表型鑒定 rSp的吖啶黃凝集試驗(yàn)、菌落結(jié)晶紫染色和沉降速度試驗(yàn)結(jié)果顯示：吖啶黃凝集試驗(yàn)陽性，能夠被結(jié)晶紫染色，細(xì)菌沉降速度明顯快于光滑型沙門氏菌，符合粗糙型S.pullorum的特點(diǎn)。

2.5 rSp傳代穩(wěn)定性檢測結(jié)果 rSp在普通培養(yǎng)基上連續(xù)傳15代后，以DrfaH-U和DrfaH-L為引物的PCR產(chǎn)物大小為336bp，序列測定結(jié)果與初代相同，表明重組菌具有良好的傳代穩(wěn)定性。

2.6 rSp的血清學(xué)反應(yīng)特性 rSp抗原與抗雞白痢陰、陽性血清均不發(fā)生凝集反應(yīng)，而CVCC79201抗原可凝集雞白痢陽性血清，與陰性血清不發(fā)生反應(yīng)。rSp抗血清與雞白痢雞傷寒多價(jià)染色平板抗原不反應(yīng)，而親本株CVCC79201抗血清能夠與該抗原發(fā)生凝集反應(yīng)(表2)。因而以該重組菌株制備的疫苗免疫動物后，不會對非重組菌感染的檢測產(chǎn)生干擾，為用rSp生產(chǎn)疫苗綜合防治雞白痢提供了可能。

表2 rSp和CVCC79201抗原及抗血清的平板凝集反應(yīng)結(jié)果Table 2Plate agglutination test of rSp and CVCC79201antigen w ith anti-serum

2.7 關(guān)于高效自殺性載體系統(tǒng)的同源重組 染色體基因重組技術(shù)基本原理是構(gòu)建含一定長度同源DNA片段的重組自殺質(zhì)粒，利用宿主自身的重組系統(tǒng)與同源重組序列交換，而經(jīng)兩次重組過程最終完成重組。這種重組技術(shù)可直接對宿主染色體進(jìn)行修飾，并在多種革蘭氏陰性菌中得到應(yīng)用。目前，高效自殺性載體系統(tǒng)和Red同源重組系統(tǒng)均能夠?qū)Ω锾m氏陰性菌染色體直接進(jìn)行修飾，但Red同源重組系統(tǒng)將在染色體中殘留FRT位點(diǎn)，而自殺性載體系統(tǒng)在染色體中除目的基因外，不保留任何外源DNA。利用該技術(shù)可以獲得具有完全生物安全意義的重組S.pullorum疫苗株，從而滿足我國對雞白痢防治的需要。

[1]沙莎，孫裕光，王琴.我國雞白痢沙門氏菌病診斷與防治研究概況[J].西南民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，29(2)：190-195.

[2]成進(jìn)，沙依然古麗.雞傷寒白痢沙門氏菌滅活菌苗的研制[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，9(1)：20-23.

[3]宋厚輝，王志亮，杜文金，等.雞沙門氏菌弱毒苗的安全性和免疫效力試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，3：202-204.

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[5]Nagy G,Danino V,Dobrindt U,et al.Down-regulation of key virulence factors makes the Salmonella enterica serovar Typhimurium rfaH mutant a prom ising live-attenuated vaccine candidate[J].Infect Immun,2006,74(10):5914-5925.