龔 倩，高淑琴，單曉楓，郭偉生，孟慶峰，王偉利*，錢愛東*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省東遼縣衛(wèi)生學(xué)校，吉林東遼136600；3.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春130062)

框鏡鯉(Cyprinus carpio)是以德國鏡鯉為親本，人工選育的優(yōu)良魚種，為吉林省淡水魚養(yǎng)殖的一個重要品種。但其抗逆性差，對病原易感性強[1]。2008年6月～7月間，吉林省某養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的框鏡鯉出現(xiàn)大量死亡，病魚主要表現(xiàn)為肛門紅腫，體表局部出現(xiàn)紅點，剖檢可見主要臟器有出血點，消化道粘膜出血。由瀕死魚體內(nèi)分離一株致病性病原菌，經(jīng)生理生化試驗，16S rRNA序列分析，鑒定該菌株為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 病料樣品來源 病魚采自吉林省某框鏡鯉養(yǎng)殖場瀕死魚；健康框鏡鯉由吉林省某養(yǎng)殖場提供，體質(zhì)量為100g左右。

1.2 主要試劑 RS瓊脂、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Prem in-Taq和DNA Marker(DL2000)購自TaKaRa公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 病原菌的分離 取發(fā)病癥狀典型的框鏡鯉，采集肌肉、心血、肝臟、胰臟等組織樣品，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板和RS瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.4 動物回歸試驗 將分離菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面28℃培養(yǎng)24h，用PBS稀釋成1.98×108cfu/m L的菌懸液，以每尾0.2m L的劑量腹腔注射接種健康框鏡鯉，對照組注射0.2m L PBS，每組各注射8尾，飼養(yǎng)水溫保持22℃左右。持續(xù)觀察7d，同時對病死魚進(jìn)行病原菌的分離，并觀察和鑒定其形態(tài)及理化特性。

另外，采集自然發(fā)病癥狀典型的瀕死魚組織臟器，添加無菌PBS(比例1g∶5m L)進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融。10000r/min離心，上清用0.22μm濾膜過濾，濾液接種健康魚，方法同上。

1.5 病原菌的鑒定

1.5.1菌體形態(tài)與菌落形態(tài)觀察將純培養(yǎng)的菌劃線接種于RS瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)；挑取單個菌落做革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.5.2主要生化性狀測定參照微量生化反應(yīng)管說明書鑒定分離菌純培養(yǎng)物。

1.5.316S rRNA基因序列分析挑取單個菌落于滅菌水中，99℃10min變性后4℃12000r/min離心5min，取上清作為模板，進(jìn)行PCR擴增。引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物：上游引物AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG，下游引物ACGGTTACCTTGTT ACGACTTC。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min、55℃ 1m in、72℃ 1.5m in，30個循環(huán)；72℃5m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化。引物合成和測序由TaKaRa公司完成。

測序結(jié)果通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列相似性比較，并使用DNAStar軟件進(jìn)行分析，與GenBank中登錄的細(xì)菌株序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 藥敏試驗 將分離菌菌稀釋成5×106cfu/m L濃度，取0.1m L該濃度菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，干燥后貼上藥敏紙片，30℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈并測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 病原菌的分離與動物回歸試驗 由自然感染的瀕死魚體內(nèi)分離一株優(yōu)勢菌株，命名為CY0806，經(jīng)動物回歸試驗，腹腔接種框鏡鯉，在5d內(nèi)全部死亡，對照組無異常表明該細(xì)菌株具有較強的致病性。剖檢病死魚，病理變化與自然病死魚相同，并且從中也分離出與CY0806菌體形態(tài)和理化特性相同的細(xì)菌。而將組織濾液接種鯉魚，并未出現(xiàn)發(fā)病死亡現(xiàn)象，因此該框鏡鯉死亡的病因為細(xì)菌感染所致，而非病毒感染。

2.2 病原菌的鑒定 經(jīng)28℃培養(yǎng)24h，細(xì)菌株CY0806在營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落呈圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、白色、不透明；而在RS瓊脂上菌落呈圓形、光滑濕潤、扁平、黃色、菌落邊緣略顯粗糙、刮去菌落留下黃色菌落痕跡。鏡檢為革蘭氏陰性桿菌。

依據(jù)CY0806菌體形態(tài)和理化特性檢測結(jié)果(表1)，參照伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊、魚類和其他水生生物細(xì)菌實用鑒定手冊，初步判定CY0806為A.veronii。

表1 分離菌的理化特性Table 1Physical and biochem ical properties of the isolated bacteria

以細(xì)菌株CY0806的DNA為模板，通過16S rRNA通用引物，擴增出長度約1500bp的片段(圖1)，測序結(jié)果顯示克隆片段長1458bp。將其基因序列用BLAST進(jìn)行同源性比較，依據(jù)同源性檢索結(jié)果，選取不同氣單胞菌種屬的代表株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示其與維氏氣單胞菌16S rRNA基因序列相似性為100%(圖2)，因而從分子水平上進(jìn)一步證實細(xì)菌株CY0806為A.veronii。

A.veronii在人機體抵抗力下降時，可引發(fā)壞死性腦膜炎、敗血癥、腹瀉等疾病[2-4]。此外，該菌還可引發(fā)魚類病害：在國外有報道該菌曾引發(fā)孟加拉國魚類流行性潰瘍綜合征[5]；在國內(nèi)，研究者也陸續(xù)從中華絨螯蟹、青蝦、泥鰍和西伯利亞鱘等體內(nèi)分離出致病性A.veronii[6-9]。因此，A.veronii是一種人-獸-魚共患病原菌。本研究在國內(nèi)首次從框鏡鯉體內(nèi)分離一株致病性A.veronii。該菌株經(jīng)動物回歸試驗，顯示其對框鏡鯉具有較強的致病性，但對其他水生生物和哺乳動物是否具有致病性，還需進(jìn)一步試驗研究。

本實驗在病原菌的分離鑒定時，采取選擇性培養(yǎng)基、理化特性、16S rRNA序列分析等相結(jié)合的方法，快速得到病原菌，在鑒定時幾種方法相互驗證，使鑒定結(jié)果更可靠，最終確定CY0806為A.veronii。

2.3 藥敏試驗 菌株CY0806經(jīng)對20種藥物的敏感性試驗，結(jié)果表明：該細(xì)菌株對慶大霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、頭孢噻吩、氯霉素、紅霉素、阿奇霉素、新霉素和氟哌酸等11種藥物高度敏感，抑菌圈直徑為20mm～40mm；對卡那霉素、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、多粘菌素B、磷霉素和鏈霉素等6種藥物中度敏感，抑菌圈直徑為10mm～19mm；對四環(huán)素、新生霉素和青霉素G等3種藥物耐藥，抑菌圈直徑為0mm～9mm。該結(jié)果與潘曉藝等[7]和馬志宏等[9]所報道結(jié)果不盡相同，這可能與細(xì)菌株的來源和區(qū)域分布不同有關(guān)；此外，試驗結(jié)果在藥物防治框鏡鯉A.veronii感染時合理選擇用藥，以及耐藥規(guī)律的研究提供實驗依據(jù)。

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