黃翠琴，廖生錢，王壽昆，黃其春，鄭新添，朱興全

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364000；2.龍巖學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建龍巖364000；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州730046)

豬蛔蟲病呈世界性流行，豬蛔蟲(Ascaris suum)的耐藥性問題日趨嚴重[1-2]，其發(fā)育具有明顯的期特異性[3]。本實驗從前期構(gòu)建的豬蛔蟲感染期幼蟲差異消減cDNA文庫中篩選基因28A02(ES291024)[4]，采用半定量RT-PCR方法分析該基因在豬蛔蟲不同發(fā)育期的表達情況，并采用RACE技術(shù)擴增其全長cDNA序列，為尋找豬蛔蟲病免疫防治的靶分子奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料 豬蛔蟲采自福建省龍巖市某屠宰場。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑購自北京天根有限公司；ReverTra Ace-α-TM試劑盒購自TOYOBO公司；r Taq酶購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；5'-Full RACE試劑盒、3'-Full RACE試劑盒和DNA Ligation試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 豬蛔蟲不同發(fā)育期幼蟲和成蟲的收集與總RNA的提取 參照文獻[4]的方法對豬蛔蟲不同發(fā)育期幼蟲及成蟲進行收集，保存于液氮中備用。

按 TRIzol說明書提取蟲體總 RNA，取 5μL RNA溶液于瓊脂糖凝膠中檢測，剩余的RNA溶液貯存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 半定量RT-PCR擴增反應(yīng)及28A02基因在不同發(fā)育期的表達分析 參照ReverTra Ace-α-TM試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA初始量均為1μg。內(nèi)參基因β-actin擴增引物及條件按文獻[4]的方法進行。以已知的28A02EST序列為模板設(shè)計引物：上游引物5'-ATTGCCGAAAGGAAAGCG-3'，下游引物5'-CCACCATTCTAACATAACCACC-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

優(yōu)化Mg2+濃度、退火溫度和循環(huán)數(shù)，選擇最佳的PCR反應(yīng)條件對感染期幼蟲差異表達基因在不同發(fā)育期的表達情況進行檢測。在同一次PCR反應(yīng)中，取5μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One軟件在波長302nm對電泳條帶進行光密度測定，以28A02基因和內(nèi)參基因β-actin的積分光密度比值(IOD)代表28A02基因的mRNA的含量。RT-PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果與已知EST進行比對分析。

1.5 RACE擴增

1.5.13'RACE擴增及序列分析參照3'-Full RACE試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)已知序列設(shè)計上游引物F0：5'-AGACCTCATCCAGGCGGT GTTCC-3'和巢式引物 F：5'-ATTGCCGAAAGGAA AGCG-3'。進行3'端序列PCR擴增，PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.5.25'RACE擴增及序列分析參照5'-Full RACE試劑盒說明書對總RNA進行CIAP、TAP處理，并與5'RACE Adaptor連接，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別設(shè)計引物R：5'-CCACCATTCTAACATAACCACC-3'和巢式引物 R1：5'-GTCTGCTTCCTGACCTCGCTC TTC-3'。進行5'端序列PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行測序分析。

1.5.33'RACE和5'RACE序列拼接和驗證根據(jù)擴增得到的5'端和3'端序列，拼接全長基因，以該全長序列設(shè)計引物：F2：5'-GTTTAATTACCCAAGTT TGAG-3'； R3： 5'-TATAAAGAAAACATGGCACTA C-3'；使用TaKaRa LA Taq酶，進行PCR擴增，驗證5'和3'RACE拼接序列。

1.6 生物信息學(xué)分析 將獲得的全長cDNA序列在NCBI等數(shù)據(jù)庫進行對比分析和編碼蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測，獲得相關(guān)的生物學(xué)信息。

2 結(jié)果與討論

2.128 A02基因在不同發(fā)育期的表達分析 內(nèi)參基因β-actin和目的基因28A02PCR擴增后進行電泳檢測，用Quantity One軟件對每條電泳條帶進行光密度測定，用目的基因和內(nèi)參基因的(IOD)代表目的基因在不同發(fā)育期的表達量。結(jié)果表明，該基因在感染期幼蟲呈高豐度表達外，在肺期幼蟲有少量表達，在其它發(fā)育期均不表達(表1)。

表1 β-actin和28A02PCR產(chǎn)物電泳相應(yīng)條帶的IODTable 1The IOD of the PCR product of 28A02gene and β-actin in different developmental stages of A.suum

2.23 'RACE和5'RACE擴增結(jié)果 經(jīng)3'RACE和5'RACE擴增后，分別取產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約500bp的3'末端片段和大小約300bp的5'末端片段(圖1)。

2.33'RACE和5'RACE拼接驗證結(jié)果及分析將3'RACE和5'RACE所得序列進行拼接，得到長為864bp的序列。根據(jù)獲得的5'端和3'端已知序列設(shè)計拼接引物，PCR擴增后得到其中791bp序列(圖2)，經(jīng)測序與拼接的序列相同。該全長序列含一個完整的長為450bp開發(fā)閱讀框(ORF)，序列兩端有長為27bp的5'非編碼區(qū)(UTR)和長為387bp并且?guī)в蠵oly(A)的3'UTR，編碼149個氨基酸，蛋白分子量為16.70ku。將該序列錄入GenBank，序列號為HM 147250。

2.428 A02基因的生物信息學(xué)分析 該基因編碼的氨基酸與Caenorhabditis briggsae的CBR-ATP-4protein具有47%的相似性，與秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的ATP合酶亞單位家族成員(atp-4)有45%的相似性。該基因編碼的蛋白同時存在疏水區(qū)和親水區(qū)，有6個保守的模體結(jié)構(gòu)，一個保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與線粒體的ATP合酶的偶聯(lián)因子有關(guān)。亞細胞定位分析顯示，該蛋白位于線粒體的可能性為73.9%，提示該基因極有可能編碼線粒體ATP合酶。

ATP合酶是熱休克蛋白90(HSP90)的協(xié)同作用蛋白。HSP的表達具有其特異性和溫度依賴性，豬蛔蟲幼蟲在發(fā)育移行過程中要經(jīng)歷溫度、滲透壓等變化，其過程受HSP的調(diào)控[6]。ATP合酶B亞基蛋白在能量代謝過程中起著獨特的調(diào)節(jié)作用，能夠同時進入細胞核和線粒體，可作為抑制豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的關(guān)鍵靶分子[7]。豬蛔蟲的感染性蟲卵被宿主食入在小腸脫鞘后，經(jīng)肝、肺等一系列移行，該過程需要大量能量。上述推測提示ATP合酶可能參與幼蟲的糖代謝過程，缺少ATP合酶可能使糖原的合成受阻，導(dǎo)致幼蟲的發(fā)育停止或死亡。本實驗為進一步研究ATP合酶基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]Ho N F,Geary T G,Barsuhn C L,et al.Mechanistic studies in the transcuticular delivery of antiparasitic drugs.II:ex vivo/in vitro correlation of solute transport by Ascaris sunm[J].Mol Biochem Parasitol,1992,52(1):1-13.

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[3]Maung M.The occurrence of the second molt of Ascaris lumbricoides and Ascaris suum[J].Int JParasitol,1978,8:371-378.

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[7]周紅娟，余新炳，徐勁，等.華支睪吸蟲ATP合酶B亞基全長基因的生物信息學(xué)分析[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7(4)：315-318.