戴志紅，關孚時，蔣 卉，孫海燕，李 翠，趙丹彤，關永梅，石寶蘭，張慧芳，張瑞婷，張立春，鄧 永，江 波，孟畫詩，王在時*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.金宇保靈生物藥品有限公司，內蒙古呼和浩特010030)

豬瘟(Classical sw ine fever，CSF)是由CSF病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性豬傳染病，給世界上很多國家和地區(qū)帶來了嚴重經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織將其列為法定通報性疫病，我國將其列為一類動物傳染病。

我國目前實行強制免疫作為豬瘟防制的主要手段，因此保證疫苗質量顯得尤為重要。鑒別檢驗是動物活疫苗質量檢驗的重點之一，其目的是保證疫苗(菌毒種)的特異性，豬瘟兔化弱毒活疫苗也不例外?！吨腥A人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)[1]和《中華人民共和國獸藥典》(2005年版3部)[2]都要求對豬瘟活疫苗(包括種毒)進行鑒別檢驗，但由于鑒別檢驗用陽性血清缺乏，該工作實際并未進行，給疫苗質量監(jiān)管留下了隱患。為解決生產(chǎn)、檢驗需要，本實驗制備了豬瘟活疫苗(種毒)鑒別檢驗陽性血清，并進行了驗證試驗。

1 材料和方法

1.1 種毒和細胞 CSFV石門株(F114)、豬瘟兔化弱毒種毒(F480)、CSFV Thiverval株(F18)和 PK-15細胞(F145)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存。

1.2 主要試劑 豬瘟活疫苗(淋脾毒)，由乾元浩生物股份公司提供；豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒購于Idexx公司；豬瘟熒光抗體由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備；Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNasin和 RNase Free Water均購自北京鼎國生物公司；RNA提取試劑TRIzol Reagent和反轉錄酶SSⅢ均購自Invitrogen公司；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Gibico BRL公司；48孔細胞培養(yǎng)板購自CoStar公司。

1.3 實驗動物 實驗豬為普通健康非免疫豬，體質量20kg左右，購于內蒙某豬場，經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測為口蹄疫、豬偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病病原、抗體陰性(病原用PCR或RT-PCR方法檢測，抗體用ELISA方法檢測)，隔離飼養(yǎng)；體質量18g～22g小白鼠、體質量1.5kg～2kg日本大耳白兔、體質量350g～400g豚鼠，均為清潔級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.4 免疫原制備 按文獻方法[1]在強毒隔離動物室制備免疫原，共獲得CSFV石門株血毒4000m L(≥105MLD/m L)，-20℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血清制備 在強毒隔離動物室制備血清。選4頭豬，每頭豬免疫豬瘟活疫苗2頭份；14d后每頭豬肌肉注射免疫原100m L；以后每頭豬每隔10d肌肉或腹腔注射免疫原200m L～300m L，同時進行ELISA抗體水平監(jiān)測，直至抗體效價接近峰值時分別采血，分離血清。

1.6 血清過濾、分裝、凍干、熔封 將4批血清分別先經(jīng)0.4μm無菌濾膜加壓過濾，再經(jīng)0.22μm無菌濾膜加壓過濾；隨后用瓶頸分液器(分裝精度為±0.01m L)無菌分裝至1m L滅菌長安瓿，分裝過程中用攪拌子保持低速攪拌；按常規(guī)方法凍干后抽真空、熔封。

1.7 成品檢驗

1.7.1物理性狀、無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、真空度測定4批產(chǎn)品均隨機抽取規(guī)定數(shù)量的樣品，按文獻方法[1]和[2]進行。

1.7.2剩余水分測定采用真空干燥法[1]。

1.7.3均一性檢驗每批隨機抽取20支樣品，隨機分為2組，分別進行稱重試驗。將每支安瓿稱重后，分別仔細收集玻璃殘渣；將安瓿內容物溶解后用去離子水沖洗干凈，烘干，連同各自的玻璃殘渣分別稱重；再用安瓿打開前的總重量減去該重量，即可計算凍干血清的重量。用狄克遜準則剔除數(shù)據(jù)中的異常值[3]，再進行t檢驗和F檢驗[3-4]，即用t檢驗法檢驗兩組測定結果的平均值是否存在統(tǒng)計學差異，用F檢驗法檢驗兩組測定結果的方差是否存在顯著性差異。若兩組測定結果的均值和方差無顯著差異，則被測樣品均一性符合要求。

1.7.4特異性檢測每批隨機抽取5支樣品，同一批次復溶混合后委托農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心進行口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病毒抗體檢測(均用ELISA方法進行)。

1.7.5殘余CSFV檢測每批隨機抽取5支樣品，同一批次復溶混合后按文獻[5]和[6]的分別進行免疫熒光和套式RT-PCR檢測，以CSFV Thiverval株作陽性對照，以PBS作陰性對照。

1.7.6兔體中和效價測定將4批血清分別按照1∶400～1∶3200倍比稀釋。將豬瘟兔化弱毒種毒用滅菌生理鹽水稀釋至100兔體感染量(Rabbit infection dose，RID)/m L，與等量的稀釋血清充分混合，置10℃～15℃中和1h，其間振搖2次～3次；同時設立種毒陽性對照(50RID/m L)、陰性對照(4批血清的所有稀釋度） 和空白對照(生理鹽水)。中和結束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1m L。按文獻方法和標準[1-2]測溫。陽性對照出現(xiàn)熱反應，而陰性對照和空白對照不出現(xiàn)熱反應，則試驗成立。以中和后完全不引起熱反應的血清最高稀釋度作為該血清的中和效價。

1.8 鑒別檢驗驗證試驗 將5種經(jīng)效力檢驗合格的豬瘟活疫苗和豬瘟兔化弱毒種毒分別用滅菌生理鹽水稀釋至100RID/m L，與等量按各自中和效價稀釋的4批血清充分混合，置10℃～15℃中和1h，其間振搖2次～3次；同時設立陽性對照(50RID/m L種毒和疫苗)、陰性對照(按中和效價稀釋的血清)和空白對照(生理鹽水)。中和結束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1m L。按文獻方法和標準[1-2]測溫。陽性對照出現(xiàn)熱反應，而陰性對照和空白對照不出現(xiàn)熱反應，則試驗成立。按實際中和結果驗證各批次血清的鑒別檢驗效果。

2 結果

2.1 物理性狀、無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、真空度測定 結果均符合規(guī)定。

2.2 剩余水分測定 采用真空干燥法對抽取樣品進行了剩余水分測定，結果水分含量均低于4%(表1)。

表1 凍干血清剩余水分含量(%)Table 1The residualmoisture contents of lyophilized antisera(%)

2.3 均一性檢驗 對4批樣品(每批2組)的稱重結果進行了經(jīng)t檢驗和F檢驗，結果所有統(tǒng)計量t和F均小于其臨界值(表2)，表明每個批次內兩組測定結果的平均值和方差無顯著性差異，說明4批血清樣品的均勻性良好。

2.4 特異性檢驗 4批樣品經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測，結果口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒ELISA抗體均為陰性。

2.5 殘余CSFV檢測 將樣品復溶后分別接種PK-15細胞，再進行免疫熒光染色，結果均為陰性(圖略)；將樣品復溶后進行套式RT-PCR核算檢測，結果均為陰性(圖1)。

2.6 兔體中和效價測定 4批血清倍比稀釋后分別與豬瘟兔化弱毒種毒中和，測定兔體中和效價(表3)。

表2 均一性測定結果Table 2The results of uniform ity tests

表34 批血清的兔體中和效價Table 3The neutralization titers of 4antisera tested in rabbits

2.7 鑒別檢驗驗證試驗 將4批血清分別按各自中和效價稀釋后，與100RID/m L的CSFV種毒和5種CSF疫苗中和后分別注射大耳白兔，進行鑒別檢驗驗證試驗。結果顯示，4批產(chǎn)品中和種毒和疫苗后，均不引起家兔產(chǎn)生熱反應和其他異常反應(表4)，表明該4批血清能特異性中和豬瘟疫苗和種毒，可以用于其鑒別檢驗。

3 討 論

鑒別檢驗是活疫苗(包括其生產(chǎn)用菌毒種)的常規(guī)檢驗項目之一，其目的是保證疫苗(菌毒種)的特異性，即檢驗疫苗(菌毒種)是否具備其應有的免疫學或生物學特性。病毒類活疫苗(種毒)鑒別檢驗常用的方法是檢驗活疫苗(種毒)是否能被已知的單特異性抗體完全中和。由此可見，鑒別檢驗的目的和方法有別于外源病毒檢驗或效力檢驗，其重要性不容忽視。

表4 對種毒和5種豬瘟疫苗鑒別檢驗驗證結果Table 4Verification of identity tests to seed virus and 5CSF vaccines

為提高血清質量，本實驗采取了以下措施：對實驗豬和制備的血清進行了常見病原、抗體檢測，保證了血清的特異性；在采血前，對抗體水平進行監(jiān)測，盡量提高血清效價；在分裝前進行了2次過濾，在分裝過程中保持低速混勻，并且進行了均一性檢驗，保證了每批樣品的均一性；以免疫熒光和套式RT-PCR方法對血清進行了殘余CSFV檢測，提高了其生物安全性；用豬瘟兔化弱毒種毒和不同廠家生產(chǎn)的5種疫苗進行了鑒別檢驗驗證試驗，保證了血清的實際使用效果。

在過程中實驗豬經(jīng)強毒反復攻擊，因此該血清存在殘余強毒的風險，為此本試驗進行了殘余CSFV檢測，結果顯示免疫熒光和套式RT-PCR檢測均為陰性。經(jīng)初步分析，以下幾點因素可能有助于減少血清殘余CSFV：選擇健康狀況良好的實驗豬，基礎免疫劑量充足并且在抗體陽轉后開始攻毒；我國馴化發(fā)明的豬瘟兔化弱毒疫苗本身非常優(yōu)異，該疫苗免疫不僅能誘導完全的臨床保護(不發(fā)病)，而且能產(chǎn)生完全的“病毒學”保護(不出現(xiàn)病毒血癥，不排毒)[7]；采血時機的把握，一般在監(jiān)測到抗體峰值后一周內采血為宜。即便如此，仍不能完全排除血清殘余CSFV的可能性，因此仍有必要進行嚴格的CSFV檢測，一旦CSFV檢測結果陽性，則應該用鈷60射線照射處理，但會顯著降低抗體效價。

另外，由于易受動物個體差異、環(huán)境和人為操作等影響，在生產(chǎn)實際中用兔體反應測定豬瘟兔化弱毒含量可能存在較大誤差，因此在使用該血清進行檢驗時可以參照標定的中和效價，根據(jù)實際情況適當降低血清稀釋度進行中和試驗，確保血清能將兔化弱毒完全中和。

[1]農(nóng)業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學工業(yè)出版社，2000.

[2]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].2005年版3部，北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[3]全浩.標準物質及其應用技術[M].北京：中國標準出版社，2003.

[4]蔣子剛，顧雪梅.分析測試中的數(shù)理統(tǒng)計與質量保證[M].上海：華東化工學院出版社，1991.

[5]戴志紅，趙耘，謝磊，等.豬瘟病毒檢測技術規(guī)程[A].獸醫(yī)微生物菌種資源標準化整理整合及共享試點項目組.獸醫(yī)微生物菌種資源描述規(guī)范及技術規(guī)程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2008.

[6]戴志紅，趙耘，寧宜寶，等.豬瘟病毒FJFQ-39株的毒力鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2008，30(9)：694-698.

[7]仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗-半個世紀的回顧[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38(8)：1675-1685.