劉文鑫，馮瑜菲，楊旭東，胡文霞，師東方

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

仔豬黃痢和仔豬白痢是由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的，以嚴重腹瀉和脫水為特征的仔豬常見傳染病，常導(dǎo)致哺乳仔豬死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。ETEC帶有的黏附素性菌毛，可黏附于宿主的小腸上皮細胞，定居和增殖，產(chǎn)生致病作用[2]。ETEC菌毛主要有F4(K88)、F5(K99)、F41和 F6(987P)4種[2-3]，其中以帶有K88和K99菌毛抗原的ETEC最為常見[4]。目前，預(yù)防仔豬黃痢和仔豬白痢的主要措施是用大腸桿菌K88、K99、987P多價疫苗免疫母豬，使哺乳仔豬獲得被動免疫保護。近年來，以K88和K99菌毛為免疫原制備的高免卵黃抗體對該病良好的防治效果也得到了臨床證實[4-5]。以往制備的高免卵黃抗體均以提取的天然菌毛為免疫原，不僅成本高，操作復(fù)雜，在培養(yǎng)和增殖過程易造成病原菌擴散。

本研究以重組大腸桿菌K88ab和K99蛋白為免疫原制備了具有良好預(yù)防和治療效果的雞卵黃抗體，為仔豬黃痢和仔豬白痢卵黃抗體的制備探索新的有效方法。

1 材料和方法

1.1 菌株、實驗動物及主要試劑 大腸桿菌C83529(O141：K99)、C83915(O9：987P)、C83903(O141：K88ab)及 C83684(O139：F18ab)參考菌株，以及K88和K99單因子血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。pColdⅠ載體由本單位王君偉教授提供。油乳劑由哈爾濱生物疫苗有限公司提供。實驗用新生仔豬由黑龍江省青岡縣某種豬場提供，常規(guī)條件飼養(yǎng)。培養(yǎng)基按《中國獸藥典》配制。

1.2 免疫原制備與鑒定 根據(jù)GenBank中登錄的K88ab(M 29374)和K99(M 35282)基因序列，設(shè)計并合成特異性引物(K88ab-P1：GGATCCACTCTGATT GCACTGGCAATTGC；K88ab-P2：AAGCTTAGTAA TTGCTACGTTCAGCGGAGC。 K99-P1： GGATCCG GTACTATTAACTTCAATGGC；K99-P2：AAGCTTT AAGTGACTAAGAAGGATGC)。

分別以大腸桿菌C83903、C83529DNA為模板，擴增不含信號肽的K88ab(852bp)基因和K99基因(479bp)，并克隆于表達載體pColdⅠ，轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細胞進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)SDS-PAGE分析后經(jīng)western blot對表達產(chǎn)物進行鑒定。測定蛋白濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻[6]的方法提取K88ab及K99天然菌毛。用SDS-PAGE和western blot進行分析鑒定。測定蛋白濃度，保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻[7]的方法制備油乳劑免疫抗原，并按200u/m L的量加入雙抗。

1.3 卵黃抗體的制備 將制備的免疫原(1：K88ab菌毛蛋白、2：K88ab重組蛋白、3：K99菌毛蛋白、4：K99重組蛋白)參照相關(guān)文獻的免疫劑量[7-9]，按低(A：0.25mg/只)、中(B：0.5mg/只)、高(C：0.75mg/只)3個免疫劑量對9月齡海蘭蛋雞進行首次免疫。每種免疫原免疫9組。首免后14d和28d分別進行二免和三免。二免將一免時每種免疫原的每個免疫劑量繼續(xù)劃分為低、中、高3個免疫劑量進行免疫。二免后隨機選取某天收蛋并用試管凝集法檢測各組抗體效價，選出效價較高的組作為優(yōu)勢劑量組，三免僅將一免時的優(yōu)勢劑量組(高劑量組)和二免時的低、中、高劑量組分別進行高劑量的加強免疫，其他免疫組棄去。以K88和K99單因子血清的試管凝集價1∶640作為臨界標準，待卵黃抗體效價達到要求后，收蛋并用優(yōu)化的水稀釋-辛酸法大量提取卵黃抗體。

1.4 卵黃抗體安全檢驗 按《中國獸藥典》附錄中對相關(guān)生物制品的標準，對提取的卵黃抗體進行物理性狀檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗及小鼠皮下注射實驗[10]。

1.5 卵黃抗體特異性檢驗 參照文獻[11]，將氯仿法提取的卵黃抗體分別與 K88ab+、K99+、987P+、F18+大腸桿菌做玻板凝集試驗。滅菌生理鹽水為陰性對照，K88和K99單因子血清為陽性對照。

1.6 卵黃抗體效價檢測 用試管凝集方法，以培養(yǎng)18h的大腸桿菌菌液作為抗原，用氯仿抽提法提取各組卵黃抗體進行檢測，確定各組抗體效價[12]。將卵黃抗體于-20℃條件下儲存4個月，利用試管凝集方法檢測其抗體效價。

1.7 卵黃抗體效力評價

1.7.1吸附及吸附抑制實驗參照文獻[12]和[13]的方法制備仔豬小腸上皮細胞懸液，用未處理的大腸桿菌及用卵黃抗體處理過的大腸桿菌與上皮細胞作用，涂片固定后，用革蘭氏染色法染色，油鏡觀察吸附及吸附抑制情況。

1.7.2預(yù)防實驗取同期新生健康仔豬6窩，每窩(10頭～13頭)平均分成2組，分別灌服試管凝集效價≥1∶640的1∶9稀釋的高免卵黃液和經(jīng)水稀釋-辛酸法粗提的卵黃抗體，每頭豬每天灌服一次(5m L/次)，出生后每周前3d灌服，連續(xù)3周。6窩仔豬分別灌服抗重組K88ab蛋白卵黃抗體、抗重組K99蛋白卵黃抗體、抗K88ab菌毛卵黃抗體、抗K99菌毛卵黃抗體、抗重組K88ab+K99蛋白卵黃抗體及抗K88ab+K99菌毛卵黃抗體。以同期出生的其它仔豬對照。逐天觀察預(yù)防效果。

1.7.3治療試驗選取臨床確診為仔豬黃痢和仔豬白痢的各日齡仔豬共70只，分別口服抗K88ab和K99菌毛的混合高免卵黃液及水稀釋-辛酸法粗提的卵黃抗體，每天5m L，連續(xù)3d，觀察治療效果。

2 結(jié)果

2.1 免疫原鑒定 重組表達載體的測序結(jié)果顯示，擴增并插入表達載體的K88ab和K99基因與Gen-Bank中登錄的序列同源性達100%。經(jīng)SDS-PAGE及western blot分析，表達的重組大腸桿菌K88ab和K99蛋白大小約30ku和19.6ku，提取的K88ab和K99天然菌毛蛋白大小約28ku和14ku，均與預(yù)期大小一致(圖1)。經(jīng)測定重組大腸桿菌K88ab和K99蛋白濃度分別為5.36mg/m L和3.02mg/m L，提取的K88ab和K99天然菌毛蛋白濃度分別為1.64mg/m L和2.56mg/m L。

2.2 卵黃抗體特異性檢驗 平板凝集試驗結(jié)果顯示，抗K88ab卵黃抗體與C83903(K88ab+)出現(xiàn)顆粒狀凝集，抗K99卵黃抗體與C83529(K99+)出現(xiàn)顆粒狀凝集，與陽性對照相符。與987P+、F18+大腸桿菌及生理鹽水均未出現(xiàn)任何凝集現(xiàn)象。

2.3 卵黃抗體安全檢驗 制備的卵黃抗體為略帶白色的澄清液體，無沉淀、凝塊、絮狀物。在相應(yīng)培養(yǎng)基上均無細菌、霉菌及真菌生長，昆明鼠皮下注射卵黃抗體10d后均未見不良反應(yīng)，表明制備的卵黃抗體安全性良好。

2.4 制備的卵黃抗體效價檢測 一免時4種免疫原的高劑量子在二免后效價最高(圖略)，僅將此組做第三次加強免疫。三免后1周卵黃抗體的試管凝集價最高可達1∶1280。三免后3周卵黃抗體試管凝集價最高為1∶2560。三免后5周卵黃抗體效價降至臨界水平(圖2)?？贵w效價在臨界值以上的持續(xù)時間為1個月。

提取的卵黃抗體于-20℃條件下儲存4個月后，試管凝集價為1∶2560。效價無明顯變化。

2.5 體外吸附與吸附抑制實驗 油鏡觀察顯示，用相應(yīng)卵黃抗體處理前大腸桿菌C83529(K99+)和C83903(K88ab+)能明顯的吸附于仔豬小腸上皮細胞(圖3a～3b)，用相應(yīng)卵黃抗體處理后大腸桿菌喪失了吸附小腸上皮細胞的能力(圖3d～3g)。

1:The purified recombinant K99protein;3:The purified recombinantK88ab protein;4:The fimbriae of E.coli C83903(K88ab+);6:The fimbriae of E.coli C83529(K99+);2,5,7:Molecularweight Marker(12ku-80ku);8:K88ab pili from E.coli C83903(K88ab+);9:Expression product of K88ab protein;11:K99pili from E.coli C83529(K99+);12:Expression productof K99protein;10,13:MolecularweightMarker(12ku-80ku)

圖2 三免后卵黃抗體效價檢測Fig.2Detection of egg yolk antibody titer post 3rd immunication

2.6 預(yù)防試驗 在預(yù)防試驗的3周內(nèi)，灌服卵黃抗體的仔豬精神狀態(tài)良好，除灌服抗K99蛋白卵黃抗體組有6頭在灌服的前2周發(fā)生腹瀉外，其余各組均未發(fā)生腹瀉。預(yù)防有效率為100%，保護率為91%(64/70)。

a:E.coli C83903(K88ab+)attachment to epithelial cells of new piglets;b:E.coli C83529(K99+)attachment to epithelial cells of new piglets;c:Negative control;d:Anti-attachmentof K88ab pilus egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets;e:Anti-attachment of K88ab protein egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets;f:Anti-attachmentof K99pilus egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets;g:Anti-attachmentof K99protein egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets

2.7 治療試驗 對臨床確診為仔豬黃痢和仔豬白痢的仔豬灌服卵黃抗體3d后，仔豬腹瀉癥狀減輕或消失。治療有效率為100%，治愈率為87%(61/70)。

3 討 論

目前，對仔豬黃痢和仔豬白痢的治療和預(yù)防措施主要有母豬免疫接種E.coli多價疫苗和抗生素療法[12]，但由于抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥菌株的不斷出現(xiàn)而影響治療效果[5]，而用疫苗免疫母豬，通過初乳被動免疫保護仔豬的方法也因不同母豬初乳中抗體水平不一致，仔豬攝入初乳不足等因素，使免疫保護效果不理想[14-15]。因此，探索更加有效預(yù)防和治療仔豬黃痢和仔豬白痢的方法成為關(guān)注的熱點。

由于卵黃抗體具有產(chǎn)量大、易于制備、穩(wěn)定性好、對哺乳動物抗原有高親合力、無同源動物病原體的存在和傳播等優(yōu)點[14-15]，許多學(xué)者相繼研制和開發(fā)了針對不同病原的高免卵黃抗體用于臨床預(yù)防和治療。用于仔豬黃痢和仔豬白痢預(yù)防和治療的卵黃抗體也顯示了良好的開發(fā)前景[16]。目前針對ETEC菌毛的卵黃抗體，其免疫原均是提取的天然菌毛[16-17]。盡管天然菌毛是良好的免疫原，但制備成本高，操作煩瑣，易造成病原菌擴散。本研究結(jié)果顯示，用重組蛋白作為免疫原，具有成本低，易于純化的優(yōu)點，所制備的卵黃抗體與用天然菌毛制備的卵黃抗體相比，對仔豬黃痢和仔豬白痢同樣具有良好的預(yù)防和治療效果。該研究為仔豬黃痢和仔豬白痢卵黃抗體的規(guī)?；a(chǎn)提供了實驗依據(jù)。

[1]逄媛，沈志強，崔言順，等.仔豬腹瀉性大腸桿菌基因工程疫苗的研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007，5：2-3.

[2]Salajka E,Salajkova Z,Alexa P,et al.Colonization factor different fromK88,K99,F41and 987P in enterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from pigs[J].Vet M icrobiol,1992,32:163-175．

[3]李鵬，王家鄉(xiāng)，殷裕斌，等.K88-K99-987P-F41菌毛疫苗預(yù)防仔豬黃痢的效果[J].中國獸醫(yī)雜志，2004，40(5)：10-11.

[4]孫建華，姜中其，由昭紅，等.產(chǎn)蛋雞抗大腸桿菌F4菌毛的血清抗體和卵黃抗體消長規(guī)律的研究[J].中國獸藥雜志，2007，7：12-13.

[5]劉海生，楊增岐，張淑霞，等.抗仔豬大腸埃希菌病高免卵黃抗體粉的研制[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2009，38(4)：8-11.

[6]李虹，朱良全，劉亞華，等.大腸桿菌K88纖毛抗原的提純和抗血清的制備[J].中國獸藥雜志，2006，153(1-2)：133-140.

[7]徐福洲，王金洛，楊兵，等.抗豬產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌卵黃抗體的研制及攻毒治療試驗[J].華北農(nóng)學(xué)報，2002，17(4)：108-112.

[8]肖馳，周淑蘭，涂志，等.雞抗豬大腸埃希氏菌卵黃抗體的研制與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科技，1998，28(4)：21-23.

[9]胡子信，袁新，張岐蜀，等.雞抗豬大腸桿菌卵黃抗體的研制[J].中國生物制品學(xué)雜志，1994，32(1)：19-25.

[10]中國獸藥典委員會.中國獸藥典[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[11]唐艷林，張微，宋桂才，等.仔豬黃白痢高免卵黃抗體的試制[J].中國獸藥雜志，2009，22(1)：6-8.

[12]Yokoyama H,Peralta C R,Diaz R,et al.Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental entertotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets[J].Infect Immun,1992,60(3):998-1007.

[13]張建軍，朱國強.F18菌毛操縱子全基因克隆、表達及生物學(xué)活性[J].微生物學(xué)報，2007，22(1)：6-8.

[14]Sarker S A,Casswall T H,Juneja L R,et al.Randomized,placebo-controlled,clinical trial of hyperimmunized chicken egg yolk immunoglobulin in children with rotavirus diarrhea[J].Pediatr Gastroenterol Nutr,2001,32(1):19-25.

[15]Earsson A R,Balow M.Chicken antibody taking advantage of evolution a review[J].PouL Sci,1993,72:1807-1812.

[16]高云英，趙發(fā)苗，張金良.雞抗豬大腸桿菌高免卵黃抗體的研制與應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2003，22(1)：6-8.

[17]李國平，周倫江，姚金水，等.雞抗豬大腸桿菌卵黃抗體的研制與應(yīng)用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002，31(1)：89-91.