邵昱昊，韓宗璽，李慧昕，孔憲剛，劉勝旺

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

果子貍源呼腸孤病毒MPC/04株全基因組序列測(cè)定與分析

邵昱昊，韓宗璽，李慧昕，孔憲剛，劉勝旺*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

為獲得果子貍源呼腸孤病毒(MRV）Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04）株的全基因序列，本研究根據(jù)GenBank中登錄的哺乳動(dòng)物MRV基因序列設(shè)計(jì)了22對(duì)引物，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)該毒株的各個(gè)基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增和同源性分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示該毒株L1、L2、M1和S3基因核苷酸序列與SARS病人體內(nèi)分離到的SARS病毒T2/BYD1/human/Song/2006(T2S）株同源性較高，該病毒株L3、M2、M3、S1、S2和S4基因核苷酸序列與病豬體內(nèi)分離到的MRV株SC-A/pig/Zeng/2006(SC-A）同源性較高，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)同樣表明各個(gè)病毒株的不同基因節(jié)段均具有不同的進(jìn)化過(guò)程，推測(cè)MRV不同病毒株之間存在重配現(xiàn)象。通過(guò)MPC/04株S1基因同源性分析和核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，表明該病毒株S1基因與MRV血清3型的S1基因同源性較高，而與其它血清型的同源性較低，因此初步判斷該病毒株血清型為血清3型。

呼腸孤病毒；基因組；序列分析

哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒(Mammalian orthoreovirus，MRV）是雙鏈RNA病毒，無(wú)囊膜，屬呼腸孤病毒科(Reoviridae），正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus）。MRV基因組由10條線性dsRNA組成，分別為3個(gè)大的基因節(jié)段 L1、L2、L3，3個(gè)中的基因節(jié)段 M1、M2、M3和4個(gè)小的基因節(jié)段S1、S2、S3、S4。10個(gè)基因節(jié)段分別編碼11種蛋白，包括8種結(jié)構(gòu)蛋白及3種非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。MRV共存在4個(gè)血清型。其代表株分別為血清1型Lang株(T1L）、血清2型Jone株(T2J）、血清 3型 Dear株(T3D）和血清 4型Ndelle病毒(NDEV）[2]。MRV的宿主范圍非常廣泛，幾乎所有哺乳動(dòng)物的體內(nèi)均能檢測(cè)出MRV的抗體。MRV可引起動(dòng)物嚴(yán)重呼吸窘迫綜合征和肺纖維化[3-4]，在患腦膜炎的兒童和SARS病人體內(nèi)均分離得到MRV[5-6]。到目前為止MRV的致病作用尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)1株從野生果子貍分離到的MRV株Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04）株的全基因組進(jìn)行了測(cè)定與分析。同時(shí)根據(jù)S1基因在病毒血清型分型中的作用，通過(guò)S1基因的序列分析，初步確認(rèn)了該毒株的血清型，為今后MRV血清型分型及MRV基因組結(jié)構(gòu)與功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及引物 感受態(tài)細(xì)胞DH5α和Vero-E6細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；pMD18-T、鼠源反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自Gibco公司；DNA柱式凝膠回收試劑盒及病毒提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。根據(jù)GenBank中登錄的MRV序列設(shè)計(jì)22對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

1.2 病毒RNA提取及基因的擴(kuò)增、克隆與測(cè)定用TRIzol RNA試劑提取病毒基因組RNA。采用RT-PCR方法對(duì)其10個(gè)基因完整或分段擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物回收，連接于pMD18-T載體中。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 MPC/04株各基因片段序列分析 將MPC/04株各基因ORF序列與TIL、T2J、T3D、T2S(BYD1）、SC-A株全部基因片段序列和血清4型NDEV的5個(gè)基因序列進(jìn)行同源性分析，繪制氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，分析各病毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.4 血清型分析 針對(duì)S1基因保守區(qū)和全基因序列的比對(duì)分析，確認(rèn)病毒的血清型[11]。將MPC/04株S1基因序列，與GenBank中登錄的同源性較高的病毒基因序列進(jìn)行比對(duì)，選取3個(gè)血清型的代表株，使用MEGA4繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行同源性分析，分析病毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，用以確定該病毒株的血清型。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒基因組核苷酸序列 MPC/04株核苷酸序列已錄入 GenBank(GQ468266～GQ468275）。L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3 和 S4 的 ORF大小分別為3 804 bp、3 870 bp、3 828 bp、2 211 bp、2 127 bp、2 166 bp、1 368 bp、1 257 bp、1 101 bp和1 098 bp。

2.2 MPC/04株病毒基因組分析 MPC/04同源性分析結(jié)果見(jiàn)表2。MPC/04株的L1、L2、M1和M3基因節(jié)段與T2S(BYD1）株的同位基因核苷酸同源性最高。L3、M2、M3、S1、S2和S4與SC-A株的同位基因同源性最高。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖1）分析表明，MPC/04株的各個(gè)片段均有不同的進(jìn)化史，這與以往的報(bào)道相一致。L1基因的氨基酸同源性分析表明其與T2S同源性最高為98.9%，與T1L和SC-A同源性為98%，與T2J同源性最低為91.7%；從圖1-A可得出L1進(jìn)化與血清型無(wú)關(guān)的結(jié)論，這進(jìn)一步證明了Leary等的報(bào)道[7]。

2.3 MPC/04株病毒血清型分析 不同病毒株S1基因之間的同源性分析表明，MPC/04株同T3D和SC-A株同源性高，核苷酸同源性分別為85.5%和93.3%，氨基酸同源性分別為91.6%和94.3%(表2）。而該病毒株S1基因與T1L、T2J和T2S同位基因同源性均較低，氨基酸同源性最高也僅為26.7%(圖1-G）。T3D、SC-A和MPC/04均在同一進(jìn)化分支上，而其它病毒株則在不同的分支上。圖2表明，在該系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，同一血清型MRV均位于同一進(jìn)化分支中。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，MRV的S1基因可分為A、B、C、D、E、F 6個(gè)亞型，其中A亞型為MRV1型，B亞型為MRV2型，其它幾個(gè)亞型均為血清3型。針對(duì)MPC/04株和國(guó)內(nèi)在豬體內(nèi)分離到的SC-A株的S1基因，與以往報(bào)道的S1基因比較顯示處于相對(duì)的不同分支上，表明MRV MPC/04株血清型應(yīng)為MRV血清3型。

MRV血清型的鑒定主要依據(jù)血清學(xué)試驗(yàn)以及血凝抑制試驗(yàn)來(lái)確定，但本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法對(duì)MRV的血清型進(jìn)行分析。Decaro等在狗體內(nèi)分離到一株MRV[11]，并根據(jù)S1基因不同血清型保守區(qū)的不同對(duì)其分離株進(jìn)行了血清型分型。本研究根據(jù)獲得的MPC/04株S1基因序列與MRV現(xiàn)有病毒株的S1進(jìn)行比對(duì)分析，也表明MPC/04株血清型為MRV血清3型。

表1 擴(kuò)增用RT-PCR引物Table 1 Primer for RT-PCR

表2 MPC株與其它MRV株全基因組序列同源性比較Table 2 Percentages of nucleotide identity of the strain MPC/04 with the(almost）completely sequenced MRV strains

根據(jù)MPC/04全基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)表明，MRV各基因節(jié)段具有獨(dú)立的拓樸結(jié)構(gòu)，各基因組節(jié)段的分子進(jìn)化過(guò)程是相對(duì)彼此獨(dú)立的，與Chappel等對(duì)S2基因的遺傳多樣性的分析結(jié)果相一致[13]，證明病毒基因組重配現(xiàn)象的存在。MRV的宿主范圍較廣，不僅能引起鼠和靈長(zhǎng)類呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，還可引起人的呼吸道和腸道疾病，由于MRV明顯缺乏種間屏障，所以存在由動(dòng)物傳播給人類的潛在可能性，因此獲得MPC/04全基因序列有助于對(duì)該病毒的遺傳演化史進(jìn)行分析，也有助于研究MRV是否存在公共衛(wèi)生學(xué)方面的意義。本研究是國(guó)內(nèi)外首次獲得果子貍源MRV的全基因組序列，該序列的測(cè)定為研究MRV的流行規(guī)律和生物學(xué)背景提供了資料，也為研究MRV分子變異致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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Whole genome sequencing of Mammalian orthoreovirus MPC/04 strain from Masked Civet Cats

SHAO Yu-hao,HAN Zong-xi,LI Hui-xin,KONG Xian-gang,LIU Sheng-wang*
(Division of Avian Infectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

The whole genome of Mammalian orthoreovirus(MRV）Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04）strain was sequenced using 22 pairs of specific primers derived from the published sequences of MRV.Nucleotide sequence analysis showed that the segment L1,L2,M1 and S3 of the genome shared the highest identity with those of strain T2/BYD1/human/Song/2006(T2S）isolated from a SARS patient,and the segment L3,M2,M3,S1,S2 and S4 had the highest homology with those of strain SC-A/pig/Zeng/2006(SC-A）isolated from pig.Phylogenetic tree analysis showed that each segment had an independent evolutionary path,indicating that reassortment was evident during evolution.Based on the S1 sequence and phylogenetic analysis,it was concluded that the MPC/04 strain belong to the MRV serotype 3.

Mammalian orthoreovirus;genome;sequence analysis

S852.61

A

1008-0589(2010）08-0627-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.12

*Correspondingauthor

2009-08-18

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃）(2005CB522905）

邵昱昊(1976-），男，黑龍江海倫人，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：SWLIU@hvri.ac.cn

(本文編輯：陳立群）