于慧珠，岳 城，陳兆國(guó)， 米榮升，夏延富

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/上海動(dòng)物生物技術(shù)研究中心，上海 200232；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

隱孢子蟲鼠基因型卵囊壁蛋白CP41基因的原核表達(dá)及抗血清的制備

于慧珠1,2，岳 城2，陳兆國(guó)1*， 米榮升1，夏延富3

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/上海動(dòng)物生物技術(shù)研究中心，上海 200232；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

為克隆和表達(dá)編碼隱孢子蟲鼠基因型卵囊壁蛋白CP41基因，以隱孢子蟲鼠基因型卵囊總RNA作為模板，RT-PCR擴(kuò)增CP41基因，克隆到pMD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-5x-3-CP41，轉(zhuǎn)化BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白，western blot分析該重組蛋白的免疫活性。結(jié)果顯示，克隆的目的基因核苷酸序列與GenBank登錄中的序列比較，同源性為90.5%，氨基酸序列同源性為87.57%。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式高效表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白大小約為46 ku，western blot分析顯示，純化復(fù)性后的重組蛋白可被辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST）單克隆抗體、隱孢子蟲兔基因型感染兔血清特異性識(shí)別。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，該蛋白3次免疫無特征病原體新西蘭白兔后，兔血清特異性抗體達(dá)到較高水平，表明表達(dá)的重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性。

隱孢子蟲鼠基因型；卵囊壁蛋白；CP 41；克??；原核表達(dá)

隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis）是隱孢子蟲寄生于人和其它脊椎動(dòng)物的胃腸道和呼吸道粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種以腹瀉為主的人獸共患寄生性原蟲病。該病在全球廣泛分布，人畜感染率高危害嚴(yán)重。目前，多數(shù)學(xué)者公認(rèn)的隱孢子蟲有效種有19種，此外，還有超過44個(gè)隱孢子蟲基因型[1]。隱孢子蟲鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype）過去稱微小隱孢子蟲鼠基因型(Cryptosporidium parvummouse genotype），是其中一個(gè)重要的、跨地域保守的基因型，廣泛存在于鼠類、蝙蝠以及牛等動(dòng)物中[2]。在我國(guó)曾有報(bào)道發(fā)現(xiàn)存在于人[3]。

血清學(xué)方法是檢測(cè)人和動(dòng)物是否感染隱孢子蟲的重要方法之一[4]，目前有多種隱孢子蟲抗原已經(jīng)得到鑒定和克隆[5-6]。Jenkins等從微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum）牛基因型AUCP-1株基因組DNA文庫(kù)中鑒定了一個(gè)種特異性卵囊壁蛋白CP41。盡管該基因序列出現(xiàn)在多種隱孢子蟲卵囊基因組中，但免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)顯示CP41蛋白免疫后制備的血清僅與C.parvum卵囊裂解物反應(yīng)，而與貝氏隱孢子蟲(C.baileyi）、火雞隱孢子蟲(C.meleagridis）和蛇隱孢子蟲(C.serpentis）均不反應(yīng)。對(duì)C.parvum和C.baileyi卵囊總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)僅有C.parvum能夠擴(kuò)增出CP41基因，而C.baileyi無法擴(kuò)增，表明抗原CP41可能在隱孢子蟲免疫診斷上有種特異性[7]。但基因閱讀框不完整，3'端沒有終止密碼子。Kjobs等對(duì)上述牛源C.parvumCP41基因原核表達(dá)的重組抗原與卵囊可溶性粗抗原對(duì)人血清的診斷效果進(jìn)行了評(píng)估，通過ELISA方法檢測(cè)192份健康成人血清中的抗隱孢子蟲IgG抗體，發(fā)現(xiàn)兩種抗原檢測(cè)結(jié)果一致率達(dá)88%，結(jié)果顯示應(yīng)用重組抗原CP41可以提供標(biāo)準(zhǔn)、可靠的檢測(cè)方法[4]。

本研究首次對(duì)隱孢子蟲鼠基因型CP41基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，并對(duì)獲得的重組抗原進(jìn)行了初步的抗原性分析，為進(jìn)一步利用該重組抗原進(jìn)行隱孢子蟲病免疫診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲種 隱孢子蟲鼠基因型卵囊由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存，接種昆明系小鼠進(jìn)行大量繁殖。用飽和鹽水漂浮法收集卵囊，采用蔗糖密度梯度法[8]純化卵囊。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、LATaq酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、Oligo d(T）18、EcoRⅠ、SalⅠ和HindⅢ 購(gòu)自TaKaRa公司；DNA Marker、蛋白質(zhì)MarkerⅡ購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Bay Gene Inc；辣根過氧化物酶(HRP）標(biāo)記GST的單克隆抗體(MAb）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L）多克隆抗體購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Gaithersburg，MD公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Montanide ISA 206佐劑購(gòu)自法國(guó)Seppic公司；大腸桿菌 DH5 α、BL21(DE3）和pGEX-5x-3由本實(shí)驗(yàn)室保存；兔抗隱孢子蟲兔基因型陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 引物的設(shè)計(jì)和合成及目的基因克隆 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道從奶牛分離的C.parvum的CP41基因序列[7]，利用DNAStar設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物。F：5'-GAGATG GACTATTCTAGG-3'； R： 5'-AGCATTAGTAGCAA CAGTAG-3'，引物由上海英俊生物有限公司合成。采用TRIzol試劑提取隱孢子蟲鼠基因型卵囊的總RNA，以O(shè)ligod(T）18為引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體積為 50 μL，反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 5 min；94℃30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pMD18-T中，經(jīng)酶切鑒定，命名為pMD-CP41。

1.4 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將pMD-CP41和原核表達(dá)載體pGEX-5x-3均用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用EcoRⅠ和SalⅠ對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序鑒定，命名為pGEX-CP41。

1.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組菌37℃培養(yǎng)至OD600nm約0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)7 h。每隔1 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。另取IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)菌，經(jīng)液氮凍融、超聲裂解后用SDS-PAGE分析重組蛋白的存在形式。

1.6 重組蛋白的復(fù)性純化 超聲裂解表達(dá)菌體，沉淀用8 mol/L尿素溶解，裂解菌體經(jīng)梯度透析復(fù)性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。復(fù)性后的蛋白經(jīng)GST親合柱分離純化，BandScan軟件分析蛋白的純度。

1.7 重組蛋白的免疫原性檢測(cè)

1.7.1 重組蛋白的western blot分析復(fù)性的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC）膜上，經(jīng)5 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別與1 μg/mL鼠抗GST MAb和1∶200稀釋的兔抗隱孢子蟲兔基因型陽(yáng)性血清各溫育1 h，并設(shè)正常兔血清作對(duì)照，洗滌后再分別與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000）2個(gè)二抗各溫育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB）顯色。

1.7.2 重組蛋白免疫兔血清的制備采用頸背部及腳掌多點(diǎn)注射免疫法，將復(fù)性純化后的重組蛋白分別與弗氏和Montanide ISA 206佐劑充分乳化后，免疫雄性SPF新西蘭白兔，免疫3次，每次間隔2周。3次免后第2周采血分離血清。

1.7.3 ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)以2 μg/mL的重組蛋白4℃包被過夜，50 g/L脫脂奶粉37℃封閉2 h。與不同稀釋度的重組蛋白免疫兔血清37℃溫育1 h，與1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG于37℃溫育1 h，四甲基聯(lián)苯胺底物緩沖液37℃反應(yīng)10 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定吸光度(OD450nm），檢測(cè)重組蛋白免疫SPF兔血清中特異性抗體水平，評(píng)估免疫血清的抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 CP41基因的RT-PCR擴(kuò)增 應(yīng)用CP41引物序列，以隱孢子蟲鼠基因型cDNA為模板，擴(kuò)增出約550 bp的片段，與預(yù)期大小相符(圖1）。重組質(zhì)粒pMD-CP41經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，結(jié)果與預(yù)期大小相符。

2.2 CP41基因核苷酸序列分析 將測(cè)序的CP41基因片段序列與GenBank中登錄的奶牛源AUCP-1分離株核苷酸序列(AF144621）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果隱孢子蟲鼠基因型序列有53個(gè)核甘酸差異，同源性為90.50%，特別是在序列的357 bp處，新插入30 bp的序列，而在509 bp處，缺失了9 bp，但沒有導(dǎo)致讀碼框的改變。預(yù)測(cè)的編碼氨基酸序列有23個(gè)氨基酸差異，氨基酸序列的同源性為87.57%。

生物信息學(xué)分析顯示，CP41蛋白N端不具有信號(hào)肽，也無跨膜結(jié)構(gòu)。疏水性分析顯示該蛋白疏水性基團(tuán)僅占總數(shù)的26.92%。預(yù)計(jì)編碼的蛋白大小為19.47 ku。克隆的隱孢子蟲鼠基因型CP41基因序列已錄入GenBank，登錄號(hào)為EU532138。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CP41的雙酶切鑒定 將重組質(zhì)粒pGEX-CP41用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，得到兩條帶，與預(yù)計(jì)片段大小相符。序列測(cè)定結(jié)果表明插入方向與蛋白讀碼框均正確，可利用載體上的終止子TGA終止表達(dá)。

2.4 重組質(zhì)粒的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析pGEX-CP41轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5 h表達(dá)量增高。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白在上清中未發(fā)現(xiàn)，但能夠溶解在8 mol/L尿素中，為包涵體形式表達(dá)，重組蛋白的分子量約為46 ku，與預(yù)測(cè)的大小一致。BanScan軟件分析顯示表達(dá)的重組蛋白為菌體總蛋白的44.2%；復(fù)性的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GST親和層析純化，獲得了較純的目的蛋白，BanScan軟件分析顯示純化后的重組蛋白約占純化后總蛋白的71.7%(圖2）。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的免疫活性分析 Western blot結(jié)果顯示，重組CP41與兔抗隱孢子蟲兔基因型陽(yáng)性血清及鼠抗GST MAb出現(xiàn)特異性反應(yīng)，反應(yīng)條帶同預(yù)期的大小一致，而與正常兔血清沒有反應(yīng)(圖3）。

ELSIA檢測(cè)結(jié)果表明，純化復(fù)性的重組蛋白經(jīng)3次免疫后，產(chǎn)生了較高效價(jià)的血清抗體，血清經(jīng)51 200倍稀釋后，抗體效價(jià)仍遠(yuǎn)高于對(duì)照組。2種佐劑免疫效果均較好，其中弗氏佐劑的免疫效價(jià)更高(表 1）。

3 討論

表1 免疫兔血清抗體效價(jià)ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 1 Rabbit serum antibody titer detected by ELISA

卵囊壁蛋白CP41是具有較高免疫原性的隱孢子蟲種特異性蛋白，由Jenkins等鑒定提出CP41可能在隱孢子蟲病的免疫診斷中具有種特異性[7]。本研究提取了隱孢子蟲鼠基因型卵囊的總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出了549 bp的片段，表明隱孢子蟲鼠基因型卵囊總RNA中也存在該蛋白的mRNA。對(duì)該片段的核苷酸序列分析顯示，同源性為90.50%，特別是在357 bp處，新插入30 bp的序列，導(dǎo)致預(yù)計(jì)的氨基酸序列有23個(gè)殘基的差異，同源性為87.57%。由于隱孢子蟲基因組中很少含有內(nèi)含子，而且Jenkins等是利用天然CP41蛋白免疫血清從C.parvum基因組DNA文庫(kù)中通過免疫篩選獲得的[7]。因此，該插入的序列不可能是內(nèi)含子。本研究克隆的CP41基因來源于分離自中國(guó)的隱孢子蟲鼠基因型，而Jenkins等研究時(shí)采用了來自美國(guó)的牛源微小隱孢子蟲(AUCP-1株）[7]。筆者推測(cè)這可能是由于隱孢子蟲的種型特異性造成的，也可能是不同地理間隔造成的，具體原因還有待于進(jìn)一步研究?？寺〉哪康幕蚪?jīng)大腸桿菌表達(dá)，重組蛋白分子量約為46ku，大部分以包涵體的形式存在。聯(lián)合運(yùn)用稀釋和透析的方法復(fù)性包涵體蛋白，經(jīng)western blot檢測(cè)，復(fù)性的重組蛋白可分別可與鼠抗GST MAb、隱孢子蟲兔基因型陽(yáng)性兔血清識(shí)別，表明復(fù)性的重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性。將復(fù)性的蛋白免疫SPF兔，經(jīng)2次加強(qiáng)免疫后，誘導(dǎo)了很高效價(jià)的抗體，表明該蛋白具有良好的免疫原性。

此外，本研究利用CP41特異性引物，對(duì)C.baileyi、豬基因型Ⅱ (pig genotypeⅡ）卵囊總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，但均未擴(kuò)增出CP41基因，證實(shí)了Jenkins等關(guān)于該基因的轉(zhuǎn)錄具有種特異性的推測(cè)，也證實(shí)該基因的轉(zhuǎn)錄存在型特異性。但這還需要通過檢測(cè)更多隱孢子蟲種、型，以及進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

本研究曾先后試用過 pET-28b(+）、pET-40b(+）、pET-41b(+）作為表達(dá)載體，但表達(dá)效果都不理想。這表明在進(jìn)行抗原基因的原核表達(dá)時(shí)，選擇合適的表達(dá)載體相當(dāng)重要。

本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行重組CP41蛋白的免疫時(shí)，分別選用206佐劑和弗氏完全、不完全佐劑協(xié)同進(jìn)行免疫，結(jié)果兩種佐劑混合免疫均產(chǎn)生了較高效價(jià)的血清抗體，其中弗氏佐劑的免疫效價(jià)更高，表明該佐劑與重組蛋白的協(xié)同免疫效果更理想。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了具有較好免疫活性的CP41重組蛋白，為進(jìn)一步利用該重組蛋白進(jìn)行隱孢子蟲病免疫診斷研究，建立靈敏、特異、標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and prokaryotic expression ofCryptosporidiummouse genotype oocyst wall protein CP41 gene

YU Hui-zhu1,2,YUE Cheng2,CHEN Zhao-guo1*,MI Rong-sheng1,XIA Yan-fu3

(1.Shanghai Research Center of Animal Biotechnique,Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agricultural,Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 200232,China;2.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumchi 830052,China;3.College of Veterinary Medicine,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China）

The oocyst wall protein CP41 gene ofCryptosporidiummouse genotype was amplified from total RNA by RT-PCR,sequenced and compared with that fromC.parvumin GenBank.The sequences shared 90.5%nucleotide and 87.57%amino acid identities with the published sequences.The gene fragment was subcloned into pGEX-5x-3 vector and transformed intoE.coliBL21(DE3）.Recombinant protein was expressed after IPTG induction and identified by SDS-PAGE and western blot.The expressed proteins were used to immunize rabbit,specific antibodies were detected by ELISA.The recombinant protein was about 46 ku and mainly existed in the form of inclusion body.The protein could be recognized the positive sera againstCryptosporidiumrabbit genotype.High level antibodies againstCryptosporidiumin rabbits could be produced after 3 times immunization with the protein,indicating that the fusion protein had high reactogenicity and immunogenicity.

Cryptosporidiummouse genotype;oocyst wall protein;CP41;cloning;prokaryotic expression

S852. 72；Q786

A

1008-0589(2010）08-0622-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.11

*Correspondingauthor

2009-06-24

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2006AA10A207）；國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(2007BAD40B05）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2005）第3-4號(hào)]

于慧珠(1981-），女，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事隱孢子蟲分子生物學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：zhaoguochen@shvri.ac.cn

(本文編輯：陳立群）