陳淑紅，彭永剛，陳露菲，劉 娣，劉彥成，楊 明，王開利，張 靜，李冀宏

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站東北林業(yè)大學(xué)博士后科研流動站，黑龍江哈爾濱 150086；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江省疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150030）

褐家鼠漢坦病毒黑龍江SC106分離株S基因特征分析

陳淑紅1,3*，彭永剛2，陳露菲3，劉 娣1，劉彥成3，楊 明3，王開利3，張 靜3，李冀宏3

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站東北林業(yè)大學(xué)博士后科研流動站，黑龍江哈爾濱 150086；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江省疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150030）

為研究家鼠型(SEO）漢坦病毒(HV）黑龍江分離株的分子特征，本研究對黑龍江省SEO型新分離株SC106的S基因進行了擴增和序列分析。結(jié)果表明：SC106株S基因全長由1 775 nt組成，編碼的蛋白長429 aa，符合SEO型編碼。與HV參考毒株進行比較，SC106與SEO型同源性最高，與姬鼠型(HTN）相對較低，與其它型別同源性更低。N蛋白進化樹分析表明，SC106位于SEO型病毒所在支系，與河南株R22，黑龍江株P(guān)f26和北京株BjHD01親緣關(guān)系接近，體現(xiàn)了一定的宿主依賴性和地理簇集性。序列分析表明：SC106與黑龍江省首個SEO型分離株P(guān)f26均為SEO型中的S1亞型，它們的S基因核苷酸序列同源性也最高(99.2%），并且SC106的S基因編碼的N蛋白氨基酸序列也比較保守，由此證實，HV的進化與時間關(guān)系不大。

褐家鼠；漢坦病毒；S基因；特征

綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由漢坦病毒(Hantavirus，HV）引起的一種自然疫源性疾病，也是一種人獸共患性疾病，以高熱、低血壓、出血、少尿或腎功能損害為特征，在世界各大洲均有流行。HV屬于布尼亞病毒科的漢坦病毒屬，是分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，病毒基因組由大(L）、中(M）、小(S）3個片段組成，分別編碼病毒RNA依賴的RNA多聚酶、病毒糖蛋白G1和G2的前體蛋白、病毒的核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，NP）。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)的HV至少有近30種血清/基因型，在亞洲HFRS主要由分別被黑線姬鼠攜帶的漢灘型(Hantaan，HTN）和褐家鼠攜帶的漢城型(Seoul，SEO）病毒引起。黑龍江省是我國最早發(fā)生HFRS的地區(qū)，多年監(jiān)測證明我省已由單純性HTN疫區(qū)轉(zhuǎn)變成HTN和SEO的混合疫區(qū)。為研究黑龍江省SEO型HV的分子特征及變異情況，本研究對一株新分離的SEO型病毒S基因序列進行擴增并對其特征進行了初步分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株 2005年9月選擇在黑龍江省出血熱國家級監(jiān)測點雙城，采用夜夾法捕鼠，取鼠肺臟組織進行病毒分離，結(jié)果從褐家鼠中分離到一株SEO型漢坦病毒，編號SC106[1]。

1.2 引物 S基因分兩段擴增，兩段相互重疊。反轉(zhuǎn)錄引物為F，第一段擴增引物為F1/R1，第二段擴增引物為F2/R2，引物序列同文獻[2]。

1.3 病毒RNA提取和S基因RT-PCR擴增 采用QIAampRViral RNA Mini Kit，從反復(fù)凍融的細胞液中提取病毒RNA。S基因的RT-PCR擴增參照文獻[2]方法。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆和序列測定 取上述PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，用QIAampRGel Extraction Kit進行回收。將回收的目的片段克隆于pMD18-T載體(TaKaRa）中，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

1.5 基因序列分析 應(yīng)用Contig Express軟件進行序列拼接，用DNAStar軟件中的EditSeq程序進行ORF預(yù)測，用 DNAStar軟件 MegAlign程序中的Clustal V method進行HV S基因的同源性和進化樹分析。本研究使用的HV參考株序列來自GenBank。

2 結(jié)果與討論

2.1 SC106株S基因的序列特征 SC106株S基因全長為1 775 nt，G+C含量為42.08%，符合TA豐富的特征。S基因5'端含有42 nt的非編碼區(qū)；編碼N蛋白的 ORF(第 43 nt～第 1 332 nt）由 1 290個核苷酸組成，編碼的蛋白長為429 aa，蛋白分子量大約48.1 ku，符合SEO型編碼[3]；S基因3'端含有443 nt的非編碼區(qū)。SC106株S基因的全基因序列已錄入GenBank，登錄號為GU361893。

2.2 SC106與HV參考株S基因的同源性分析SC106與選取的22株HV參考毒株S基因進行比較，結(jié)果表明：HV 5'非編碼區(qū)核苷酸序列非常保守，SC106的3'非編碼區(qū)也同樣具有其它HV的保守區(qū)域。S基因完整的ORF編碼區(qū)進行比較，結(jié)果表明：SC106與參考毒株核苷酸序列同源性為53.5%～99.2%，與SEO型同源性較高(96.0%～99.2%），其中與黑龍江褐家鼠首次分離的Pf26株同源性最高；SC106與HTN型和DOB同源性均未超過70%，而與其它HV的同源性更低。S基因編碼的N蛋白氨基酸序列同源性分析表明：SC106與參考株同源性為60.7%～99.8%，與SEO型同源性較高，除與SR-11同源性為97.9%之外，與其余SEO型HV的同源性均大于99.0%，其中與BjHD01同源性最高，為99.8%；但是SC106與HTN型和DOB的同源性均低于84%，與其它HV的同源性更低。HV具有宿主依賴性，即一種HV主要由一種鼠所攜帶，我們的結(jié)果也證明了這一點。除此之外，HV還具有地理簇集性[4-5]，本研究表明，SC106與黑龍江株P(guān)f26核苷酸同源性最高，也證實了這一點，但是SC106氨基酸的同源性與北京株BjHD01最高，這有待于結(jié)合其它基因的同源性繼續(xù)進行研究。

SEO型HV之間N蛋白氨基酸序列比較表明：SC106的180 aa位是P，其余毒株是S，除此之外，SC106非常保守。值得注意的是SC106與Pf26同屬本省分離株，分離時間間隔是7年，它們S基因核苷酸同源性最高，N蛋白氨基酸共4處不同(54 aa、180 aa、212 aa和220 aa），除54 aa，其余變異均位于N蛋白的主要抗原表位區(qū)之外。由此表明，到目前為止，分離到的黑龍江省SEO型毒株變異不大，保守且相對穩(wěn)定，這一點也證實了HV的進化與時間和地區(qū)關(guān)系不大，而與宿主動物有關(guān)。2.3 SC106與HV參考株S基因的種系發(fā)生樹分析 根據(jù)22株HV參考株和SC106的S基因編碼的N蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖1）?？梢钥闯觯篐V明顯分為3個主要分支，即同鼠亞科(Murinae）、棉鼠亞科(Sigmodontinae）和田鼠亞科(Arvicolinae）嚙齒類動物宿主相關(guān)的3大類，在鼠亞科宿主相關(guān)的支系中又有3個分支，即褐家鼠相關(guān)的SEO型、黑線姬鼠相關(guān)的HTN型和黃頸姬鼠相關(guān)的DOB型，SC106位于SEO型病毒所在支系。

HV種類繁多，我國除HTN和SEO以外，在宿主動物中還發(fā)現(xiàn)了PUU、KHA和VLA的證據(jù)[6-7]。有研究表明，我國HTN可分為9個亞型(H1～H9），SEO可分為4個～6個亞型(S1～S6）[8]。黑龍江省流行的也是HTN型和SEO型，其中以HTN型為主。自從黑龍江省發(fā)現(xiàn)SEO型以來，尚未有本省SEO型HV亞型分型的研究。進化樹分析表明，SC106位于SEO型HV所在的支系，并且與R22、Pf26和BjHD01親緣關(guān)系更接近，由此證實SC106與黑龍江省SEO型首次分離株P(guān)f26均屬于S1亞型，此亞型與HFRS發(fā)病關(guān)系密切[8]。同時，就國內(nèi)毒株而言，SC106與Pf26、北京株BjHD01以及河南株R22更接近，而與地理位置相對較遠的浙江株Z37和江西株L99等親緣關(guān)系相對較遠，這一點也在一定程度上證實了HV的地理局簇性。

黑龍江省是我國HFRS的老疫區(qū)和重疫區(qū)，近幾年盡管黑龍江省疫情呈下降趨勢，但發(fā)病率仍然名列全國第一二位。監(jiān)測表明鼠間疫情仍然比較嚴(yán)重，對人類的威脅依然較大。由于HFRS不同疫源地的流行特征、宿主種類、臨床表現(xiàn)、病死率、控制與預(yù)防措施均有所不同，因此，對黑龍江省HV進行分離、分型及其變化的研究具有重要意義，可以為疫區(qū)型別的演變、HV的遺傳和進化以及有效預(yù)防和治療提供依據(jù)。

[1]劉彥成，陳淑紅，陳露菲，等.一株漢城型漢坦病毒的分離及基因鑒定[J].中國公共衛(wèi)生管理，2009，25(5）：487-488.

[2]孫成群，陳露菲，吳玉華，等.黑龍江省首次發(fā)現(xiàn)漢坦病毒家鼠型的分子生物學(xué)證據(jù)[J].疾病控制雜志，2000，4(4）：313-316.

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S gene sequence analysis of a hantavirus strain isolated fromrattus norvegicusin Heilongjiang area

CHEN Shu-hong1,3,PENG Yong-gang2,CHEN Lu-fei3,LIU Di1,LIU Yan-cheng3,YANG Ming3,WANG Kai-li3,ZHANG Jing3,LI Ji-hong3

(1.Postdoctoral Research Working Station of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Postdoctoral Research Station of Northeast Forestry University,Harbin 150086,China;2.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China;3.Heilongjiang Provincial Center for Disease Prevention and Control,Harbin 150030,China）

The Seoul(SEO）hantavirus SC106 isolated in Heilongjiang area,the S gene of the SC106 was amplified by PCR,sequenced and analyzed.The complete nucleotide sequence of the S gene was composed of 1 775 AT-rich nucleotides which contained one open reading frame encoding for the N protein of 429 amino acid residues.Sequence comparison of the S genes between SC106 and reference hantavirus strains showed that SC106 had higher sequence identities with Hantaan(HTN）viruses than SEO hantavirus and other hantaviruse.Phylogenetic analysis of N proteins showed that SC106 was clustered into the group of SEO type viruses and was more closely related to Henan R22 strain,Heilongjiang Pf26 strain and Beijing BjHD01 strain.The results reflected host-dependent characteristic and geographical aggregation characteristic of hantanviruse.Furthermore,the S gene of Heilongjiang SC106 isolate showed 99.2%identities with that of the Pf26 strain which was isolated seven years earlier,and the N protein was also well conserved,indicating that the evolution of hantavirus was highly conserved over time.

rattus norvegicus;hantavirus;S gene;characterization

S855.3

A

1008-0589(2010）08-0638-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.15

*Correspondingauthor

2010-01-12

黑龍江省科技攻關(guān)計劃(GC06C424）

陳淑紅(1976-），女，內(nèi)蒙古通遼人，博士，副主任技師，主要從事病毒病防治研究.

*通信作者：E-mail：chenshu2121@sina.com

(本文編輯：彭永剛）