華 濤，陶麗紅，葛金英，王喜軍，沈向真，步志高*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001）

表達(dá)綠色熒光蛋白重組狂犬病病毒Flury-LEP的構(gòu)建及其用于中和抗體檢測的研究

華 濤1,2，陶麗紅2，葛金英2，王喜軍2，沈向真1，步志高2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001）

為確定狂犬病病毒(RV）Flury-LEP株外源基因的插入位點(diǎn)及其中和抗體快速檢測方法，本研究在建立了RV Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP）的重組LEP基因組cDNA克隆pCI-LEP-EGFP，并成功拯救出重組病毒(rLEP-EGFP）。rLEP-EGFP的生物學(xué)特性和野生型LEP(wtLEP）在NA細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中的生長動(dòng)力學(xué)及對(duì)小鼠的致病性沒有顯著差異。rLEP-EGFP在BHK-21細(xì)胞中連續(xù)傳代9次，各代次重組病毒均穩(wěn)定表達(dá)EGFP。重組表達(dá)的EGFP可用于中和抗體檢測，rLEP-EGFP免疫犬血清經(jīng)間接免疫熒光(IFA）或熒光下直接觀察檢測RV中和抗體滴度，兩種檢測結(jié)果顯示較好的相似性(p＞0.05）。本研究為研制以Flury-LEP株活載體多價(jià)疫苗奠定了基礎(chǔ)，并為病毒中和抗體的檢測提供了更為快捷的新方法。

狂犬病病毒；Flury-LEP株；EGFP；反向遺傳操作；多價(jià)疫苗；病毒中和抗體

狂犬病病毒(Rabies virus，RV）為人獸共患狂犬病的病原。RV屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬，基因組為一條約12 000 nt負(fù)鏈RNA，共編碼5種病毒蛋白：核衣殼蛋白(N）、磷酸化蛋白(P）、基質(zhì)蛋白(M）、糖基化蛋白(G）和多聚酶(L）。在病毒的組裝過程中，N蛋白與基因組RNA結(jié)合，形成核糖核蛋白體(RNP），在P蛋白與L蛋白組合形成的RNA聚合酶的參與下，啟動(dòng)病毒的生物合成。

自1994年Schnell等首次利用反向遺傳操作系統(tǒng)拯救了RV的SAD B19株[1]，至今已成功拯救出的 RV SHBRV-18[2]、 Nishigahaga[3]、 Ni-CE[4]和 Evelyn-Rokitnicki-Abelset(ERA）株 等[5]。Flury-LEP 株 具有優(yōu)良的免疫原性，被廣泛用作人或動(dòng)物的狂犬病滅活疫苗種毒株，并在中國及其他一些國家用作預(yù)防犬狂犬病的弱毒疫苗。

本研究以Flury-LEP弱毒疫苗株作為活病毒載體，將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP）基因插入其G與L基因之間，拯救了表達(dá)EGFP的Flury-LEP的重組病毒(rLEP-EGFP），并通過熒光下直接觀察的方法對(duì)RV中和抗體進(jìn)行檢測，為RV重組病毒疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及細(xì)胞 RV Flury-LEP疫苗株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；BHK-21細(xì)胞、293T細(xì)胞和小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(NA細(xì)胞）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SphⅠ和MluⅠ均購自TaKaRa公司；PhusionTMTaqDNA聚合酶購自NEB公司；無血清培養(yǎng)基Opti-MEM和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000均購自Invitrogen公司；犢牛血清購自Gibco公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗購自Sigma公司；鼠抗RV的ERA株高免血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 含EGFP基因的Flury-LEP全長cDNA感染性克隆的構(gòu)建 按常規(guī)方法提取Flury-LEP病毒株RNA，并將其全長基因組分為末端部分相互重疊的F1、F2和F3的3個(gè)片段(圖1）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。并且在F1片段前加錘頭狀核酶(HamRz）序列、F3片段后加丁肝核酶(HdvRz）序列。cDNA片段克隆至pBluescript并經(jīng)序列分析與病毒基因組RNA序列完全一致后，將3個(gè)片段依次克隆至轉(zhuǎn)錄載體pCI中，構(gòu)建的病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pCI-LEP。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(表1）：第一對(duì)引物B1-f和B1-PmeⅠ-r，第二對(duì)引物B2-PmeⅠ-f和B2-r，通過SOE(Gene splicing by overlap extension）PCR方法在cDNA第4 906 bp后引入PmeⅠ限制性酶切位點(diǎn)(GTTT AAAC），獲得的PCR片段替換至pCI-LEP上的F2段，從而構(gòu)建成重組基因組轉(zhuǎn)錄載體pCI-LEP-PmeⅠ；以EGFP-PmeⅠ-f和EGFP-PmeⅠ-r為引物，以pIRES-EGFP(Clonetech）為模板，通過 PCR，在EGFP的ORF的5'端引入PmeⅠ限制酶識(shí)別序列和LEP自身聚合酶L識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止序列GE(AGAA AAAAA）及轉(zhuǎn)錄起始序列GS(AACATCCCT）；PCR產(chǎn)物經(jīng)PmeⅠ酶切插入pCI-LEP-PmeⅠ，構(gòu)建的表達(dá)EGFP重組基因組全長cDNA克隆命名為pCI-LEP-EGFP(圖1）。N、P及L基因的開放閱讀誆(ORF）cDNA分別克隆在pCAGG質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成的輔助質(zhì)粒分別命名為pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列Table 1 Primers used for PCR

1.4 重組病毒的拯救及擴(kuò)增 按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書的操作方法將pCI-LEP-EGFP、pCAGG-N、pCAGG-P 和 pCAGG-L 按 4∶2∶2∶1 的比例混合，轉(zhuǎn)染約生長為80%的293T細(xì)胞單層，8 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，將培養(yǎng)液及細(xì)胞混合物接種BHK-21細(xì)胞；48 h后用熒光顯微鏡觀察EGFP在感染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，將拯救病毒命名為rLEP-EGFP。將獲救的病毒在BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增，制備種毒，-70℃凍存，用于對(duì)救獲病毒的進(jìn)一步滴定及生物學(xué)特性分析。

1.5 病毒的滴定 rLEP-EGFP感染細(xì)胞上清液作10倍倍比稀釋，以100 μL接種于BHK-21單層細(xì)胞或NA細(xì)胞，37℃吸附1 h后洗滌2次，加入新鮮培養(yǎng)液。48 h后用熒光顯微鏡直接觀察，病毒滴度用病灶形成單位(FFU）計(jì)數(shù)表示。

1.6 生長動(dòng)力學(xué)曲線的測定 為測定病毒生長動(dòng)力學(xué)曲線，以M.O.I.為0.01分別感染單層NA細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞。感作1 h后用，用PBS洗2次后分別加0.2%胎牛血清的MEM或2%DMEM于37℃培養(yǎng)。分別于接種后24 h、72 h和120 h取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，在NA細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞上測定滴度，繪制病毒生長動(dòng)力學(xué)曲線。

1.7 LD50的測定 將rLEP-EGFP和wtLEP用PBS作10倍倍比稀釋至10-7,將10-4～10-7各稀釋度分別取30 μL腦內(nèi)接種5只5周齡～6周齡的BALB/c雌性小鼠。連續(xù)觀察21 d，記錄每組小鼠的平均體重變化和死亡情況。利用Reed-Muench法計(jì)算小鼠半數(shù)致死量(LD50）。

1.8 血清樣品 5條比格犬(No.1～No.5）肌肉注射免疫106FFU的弱毒活疫苗Flury-LEP，5條比格犬(No.6～No.10）肌肉注射免疫107FFU的滅活Flury-LEP，均于3周后采血并分離血清。

1.9 中和試驗(yàn) 血清樣品首先56℃水浴處理30 min滅活，隨后連續(xù)20倍至1 280倍倍比稀釋，同時(shí)設(shè)陰、陽性血清對(duì)照。將稀釋的血清與含10 000個(gè)FFU的Flury-LEP病毒或rLEP-EGFP病毒等體積混合，37℃孵育1 h，然后取100 μL加到過夜生長的24孔BHK-21細(xì)胞中，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.10 間接免疫熒光檢測(IFA） Flury-LEP感染后48 h進(jìn)行IFA，以鼠抗RV的ERA株高免血清為一抗、熒光素(FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma）為二抗進(jìn)行孵育后，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。rLEP-EGFP感染后48 h用熒光顯微鏡直接觀察EGFP在感染細(xì)胞的表達(dá)情況，省去了熒光抗體檢測步驟。

2 結(jié)果

2.1 重組Flury-LEP株基因組cDNA的構(gòu)建 利用相鄰重疊部分的限制酶切位點(diǎn)將基因組cDNA片段F1、F2和F3逐一克隆至轉(zhuǎn)錄載體pCI中，克隆在CMV啟動(dòng)子下游，兩個(gè)核酶之間的全長cDNA可以在真核細(xì)胞RNA聚合酶的作用下得到轉(zhuǎn)錄，并且由于核酶的自身催化功能，可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端與病毒基因組精確一致。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用基因組cDNA 4 906處引入的PmeⅠ位點(diǎn)，插入5'端引入LEP L聚合酶特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列GE和GS的EGFP基因，構(gòu)建成表達(dá)GFP的重組LEP cDNA感染性克隆pCI-LEP-EGFP。

2.2 從cDNA克隆救獲感染性重組LEP 將pCILEP-EGFP與3個(gè)輔助質(zhì)粒 pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。拯救的重組病毒感染BHK-21，48 h在熒光顯微鏡下可觀察到自發(fā)綠色熒光(圖2）。結(jié)果表明，采用反向遺傳操作技術(shù)成功地拯救了表達(dá)外源基因EGFP的感染性重組病毒rLEP-EGFP。

2.3 重組病毒的生物學(xué)特性

2.3.1 生長動(dòng)力學(xué)曲線wtLEP在非神經(jīng)元細(xì)胞BHK-21中24 h、72 h和120 h生長滴度(FFU/mL）為：3×104、6×107和 7×107，在神經(jīng)元細(xì)胞 NA細(xì)胞為：2×104、1×107和 7×107；rLEP-EGFP在BHK-21細(xì)胞同樣時(shí)間點(diǎn)的生長滴度為：1×104、1×106和 2×107，在 NA 細(xì)胞為：4×103、4×106和 2×107。wtLEP和 rLEP-EGFP在 NA和 BHK-21上的生長動(dòng)力學(xué)曲線顯示(圖3），rLEP-EGFP在兩種細(xì)胞上的的生長性能與wtLEP沒有顯著差異，這表明從重組基因組全長cDNA拯救出的rLEP-EGFP的生長特性與wtLEP是一致的，EGFP基因的插入并沒有影響病毒的增殖特性。

2.3.2 對(duì)小鼠的致病性為了確定rLEP-EGFP對(duì)小鼠的致病性，每只小鼠腦內(nèi)接種病毒105FFU/30 μL。感染rLEP-EGFP的小鼠表現(xiàn)出麻痹、興奮、體重減輕等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床癥狀，所有的小鼠在11 d內(nèi)全部死亡。rLEP-EGFP的LD50與wtLEP進(jìn)行比較，分別為6.3個(gè)FFU和8.8個(gè)FFU，結(jié)果表明這兩個(gè)毒株對(duì)小鼠的致病性沒有顯著差異。

2.3.3 LEP-GFP外源報(bào)告基因的穩(wěn)定表達(dá)將rLEP-EGFP在BHK-21細(xì)胞中連續(xù)傳代9次，各代次細(xì)胞上清分別10倍倍比稀釋100 μL體積接種24孔板培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡直接觀察結(jié)果，各代次EGFP均能穩(wěn)定表達(dá)。根據(jù)鏡下表達(dá)綠色熒光蛋白的病灶數(shù)量，確定各代次rLEPEGFP每毫升FFU介于104～107之間(圖4）。各代分別為 F1：4×104，F(xiàn)2：8×105，F(xiàn)3：2×107，F(xiàn)4：1×107，F(xiàn)5:8×106，F(xiàn)6：3×107，F(xiàn)7：2×107，F(xiàn)8：1×107，F(xiàn)9：4×107，F(xiàn)10：2×107。

2.4 rFlury-LEP的特異性中和抗體檢測 分別以Flury-LEP株和rLEP-EGFP株作為接種毒株檢測比格犬一次免疫血清中和抗體，第一組比格犬免疫弱毒疫苗，第二組比格犬免疫滅活疫苗，共檢測10份血清。以Flury-LEP株為接種毒株時(shí)需通過IFA檢測，而以rLEP-EGFP株作為接種毒株時(shí)可直接在熒光顯微鏡下觀察即可。結(jié)果表明，兩組血清由兩種方法檢測的中和抗體滴度(表2）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05）。

表2 兩種不同方法檢測犬病毒中和抗體滴度Table 2 Virus-neutralizing antibodied titers of canine sera determined by different methods

3 討論

本研究構(gòu)建表達(dá)綠色熒光蛋白pCI-LEP-EGFP感染性克隆，并救獲重組病毒rLEP-EGFP。1996年，Mebatsion等首先發(fā)現(xiàn)無論是將CAT基因插入非編碼區(qū)還是置換該區(qū)域，拯救的RV都能高效表達(dá)CAT[6]，其生物學(xué)特性與親本SAD L16相似。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)重組病毒rLEP-EGFP的遺傳穩(wěn)定性，連續(xù)9次傳代后不僅仍表達(dá)外源蛋白且能維持高滴度，與親本病毒相似。小鼠顱內(nèi)注射rLEP-EGFP和wtLEP，rLEP-EGFP致病性與親本病毒相似。本實(shí)驗(yàn)采用CMV啟動(dòng)子，結(jié)果顯示CMV進(jìn)行拯救可適用于更多的細(xì)胞系，經(jīng)過適宜的細(xì)胞系傳代所獲得的病毒滴度更高，這與Inoue等的結(jié)果相似[7]。

針對(duì)RV的病毒中和抗體(VNA）在保護(hù)動(dòng)物免于狂犬病中起著至關(guān)重要的作用，RFFIT(The rapid fluorescent focus inhibition test）和FVAN(Fluorescent antibody virus neutralization）被廣泛用于體外檢測VNA，但是這兩種方法費(fèi)用高且耗時(shí)。Khawplod[8]等在RFFIT檢測人、馬、犬血清的VNA試驗(yàn)中，用表達(dá)GFP重組rHEP-GFP毒株代替?zhèn)鹘y(tǒng)的接種毒株CVS直接檢測，與傳統(tǒng)的RFFIT相比較其檢測結(jié)果顯示很好的一致性。本實(shí)驗(yàn)利用表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒rLEP-EGFP作為接種病毒株，可在熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞感染情況。與常用的抗體滴度檢測方法IFA作比較，使用rLEP-EGFP為檢測抗原來滴定病毒中和抗體滴度，其結(jié)果同樣顯示了很好的相似性，該方法方便、經(jīng)濟(jì)且結(jié)果可靠。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采用犬的國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)血清作對(duì)照，IFA用CVS作為接種毒株,并與WHO推薦的RFFIT或OIE推薦的FVAN作對(duì)比，加大我國臨床應(yīng)用的各種狂犬疫苗免疫犬血清的獲得量，這樣rLEP-EGFP直接熒光檢測法所獲得的數(shù)據(jù)更加能對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義。

Faber等以TNF為外源基因插入到缺失φ基因的SAD B19的G-L之間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組病毒在小鼠腦內(nèi)傳播速度減慢[9]。Hosokawa-Muto等在構(gòu)建的弱毒株rRC-HL反向遺傳學(xué)系統(tǒng)基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙G蛋白R(shí)(NPMGGL）株，該弱毒株感染的細(xì)胞不但病毒滴度增加而且G蛋白表達(dá)量增加了1.5倍[10]，表明免疫效果比rRC-HL株更好。該病毒株與Dietzschold等構(gòu)建的雙G株SPBNGA-GA相比毒力更弱[11]?；蠲绲拿庖咴耘c致病力往往相矛盾的，需要一種方法解決這種矛盾，基因缺失疫苗應(yīng)運(yùn)而生。2005年，Ito等構(gòu)建了一株缺失M基因的RC-HL病毒(RC-HL△M）[12]，這種缺陷病毒不能產(chǎn)生子代病毒，只可以在組成性表達(dá)MP的BHK細(xì)胞中增殖，但MP單獨(dú)表達(dá)對(duì)細(xì)胞系是有害的。Morimoto等構(gòu)建了缺失P基因Flury HEP株[13]，在致病性和免疫效果上獲得了相似的結(jié)果。2008年，Cenna等構(gòu)建了缺失P基因雙表達(dá)GP的SPBN-△P-RVG[14]，103FFU肌內(nèi)免疫即可達(dá)到達(dá)到60%～100%對(duì)致死劑量CVS肌肉攻毒保護(hù)；SPBN-△P載體肌肉注射B細(xì)胞和T細(xì)胞缺失小鼠無致病性。SPBN-△P-RVG基因缺失株的建立為狂犬病新型安全疫苗和載體研制提供了新的思路。

本研究構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白重組病毒，該病毒可用于方便快速地測定病毒中和抗體，同時(shí)也為構(gòu)建表達(dá)犬瘟熱等其它重要病原保護(hù)性免疫原的重組病毒，研制出可同時(shí)預(yù)防狂犬病及犬瘟熱等其它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of a recombinant rabies virus expressing enhanced green fluorescent protein for the detection of virus neutralization antibodies

HUA Tao1,2,TAO Li-hong2,GE Jin-ying2,WANG Xi-jun2,SHEN Xiang-zhen1,BU Zhi-gao2*

(1.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Key Laboratory of Veterinary Public Health of Ministry of Agricultural,Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

To construct the recombinant rabies virus and develop a convenient method for virus neutralization antibodies(VNA）detection,a recombinant rabies virus rLEP-EGFP expressing enhanced green fluorescent protein(EGFP）was rescued based on infectious clone of rabies virus Flury-LEP strain.The biology characters of rLEP-EGFP were similar to that of the wild type LEP strain in respect of the growth dynamics in both NA cells and BHK-21 cells,and the pathogenicity in BALB/c mice.The EGFP expression of rLEP-EGFP was stable for at least nine passages in BHK-21 cells.The rLEP-EGFP could be used for detection of neutralization antibody in canine serum,and the results were as same as that of indirect immunofluorescence assay(p>0.05）.This LEP-EGFP system provided an useful platform for development of novel polyvalent vaccine,and a convenient and economical method for VNA detection.

book=582,ebook=65

Rabies virus;Flury-LEP;EGFP;Reverse genetic;polyvalent vaccine;virus neutralization antibodies

S852.65

A

1008-0589(2010）08-0581-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.01

*Correspondingauthor

2009-10-16

國家“973”計(jì)劃(2005CB523200）

華 濤(1981-），男，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：zgb@hvri.ac.cn

(本文編輯：趙曉巖）