劉 洋，李 媛，董 惠，張美晶，姜海芳，陳 維，辛九慶*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病研究室/國(guó)家牛傳染性胸膜肺炎指定檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001）

牛支原體雙重PCR檢測(cè)方法的建立

劉 洋1#，李 媛1#，董 惠2，張美晶1，姜海芳1，陳 維2，辛九慶1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物細(xì)菌病研究室/國(guó)家牛傳染性胸膜肺炎指定檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150001）

為鑒別牛支原體(Mycoplasma bovis）與絲狀支原體絲狀亞種SC(M.mycoidessubsp.mycoides SC），本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化M.bovis特異性引物pMB81-1/pMB81-2s和MmmSC特異性引物SC1/SC2的退火溫度，建立了鑒別M.bovis和MmmSC的雙重PCR檢測(cè)方法。該方法能夠分別由M.bovis和MmmSC擴(kuò)增得到528 bp和270 bp片段。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法檢測(cè)M.bovis和MmmSC培養(yǎng)物的最低濃度分別為106cfu/mL和105cfu/mL。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對(duì)無(wú)乳支原體代表株P(guān)G2、絲狀支原體絲狀亞種LC型代表株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種Mccp、綿羊支原體Y-98、豬鼻支原體BST-7、巴氏桿菌以及結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。應(yīng)用該方法對(duì)臨床病料的檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)鑒定結(jié)果的符合率為100%，表明該方法具有良好的特異性和敏感性，可以應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

牛支原體；絲狀支原體絲狀亞種SC；雙重PCR

#共同第一作者：劉 洋(1983-），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物支原體病研究；

李 媛(1972-），女，山東海陽(yáng)人，助理研究員，主要從事動(dòng)物分子流行病學(xué)與診斷學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：xinjiuqing2001@sohu.com

牛支原體(Mycoplasma bovis）屬支原體科支原體屬，可引起犢牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和關(guān)節(jié)炎，是危害犢牛的重要病原體[1]。牛傳染性胸膜肺炎(Contagious bovine pleuropneumonia）簡(jiǎn)稱牛肺疫，是由與M.bovis同屬的絲狀支原體絲狀亞種SC型(M.mycoidessubsp.mycoides SC）引起的烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE）列為必須呈報(bào)疾病。1961年Hale在美國(guó)首次從一例患乳腺炎的牛乳中分離出M.bovis[2]。目前，M.bovis已呈全球流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[3,7]。2008年4月，我國(guó)南方爆發(fā)了以發(fā)熱、咳嗽及呼吸困難為主要特征的牛肺炎樣傳染病疫情，經(jīng)鑒定病原體為M.bovis，而不是MmmSC[4]。自2008年以來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)蒙古等北方地區(qū)分離到M.bovis，表明該病已在我國(guó)流行。

M.bovis所導(dǎo)致的牛呼吸道相關(guān)疾病的臨床癥狀及病理特征與牛肺疫極為相似，嚴(yán)重干擾了我國(guó)無(wú)牛肺疫認(rèn)證進(jìn)程[3-4]。因此，需要一種可以快速鑒別診斷M.bovis與牛肺疫的檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化退火溫度等條件建立了可以同時(shí)鑒別檢測(cè)M.bovis和MmmSC的雙重PCR方法，為我國(guó)無(wú)牛肺疫認(rèn)證以及M.bovis相關(guān)疾病診斷提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 菌 株M.bovis湖北分離株(HB）由本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定[4]。MmmSC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1、絲狀支原體絲狀亞種LC型(M.mycoidessubsp.mycoides LC）Y-goat株、綿羊肺炎支原體(M.ovipneumonia）Y-98株及無(wú)乳支原體(M.agalactiae）PG2株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；臨床病料均來(lái)自于各地方送檢牛肺臟病料，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)鑒定為M.bovis陽(yáng)性；多殺性巴氏桿菌(P.multocida，PM）、豬鼻支原體(BST-7）和山羊肺炎支原體(M.capricolumsubsp.Capripneumoniae，Mccp）由本實(shí)驗(yàn)室保存；牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis，MB）基因組DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌室劉思國(guó)研究員提供。

1.2 主要試劑 組織/細(xì)胞DNA(小量）抽提試劑盒購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)公司；rTaq酶購(gòu)自寶生物工程(大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 選用MmmSC的公開(kāi)引物SC1/SC2[5]和文獻(xiàn)[6]中M.bovis的上游引物 pMB81-1，參考GenBank中登錄的M.bovisp81基因序列，設(shè)計(jì)下游引物 pMB81-2s(表 1）。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences of PCR

1.4 菌體培養(yǎng)與基因組提取 將PG1和HB株接種含10%馬血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至108cfu/mL～109cfu/mL。分別取純培養(yǎng)物按組織/細(xì)胞DNA(小量）抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。

1.5 最佳退火溫度選擇 以HB和PG1株等比例混合的基因組DNA為模板，退火溫度分別設(shè)置為47℃、52℃和57℃，進(jìn)行PCR反應(yīng)。20 μL體系：混 合 模 板 1 μL，SC1/SC2、 pMB81-1/pMB81-2S 各0.002 pmol， dNTP Mixture 0.004 μmol， 10 ×PCR Buffer 2 μL，滅菌去離子水 13.6 μL，rTaq酶 1 U。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃ 45 s、退火溫度下40 s、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.6 特異性試驗(yàn) 按優(yōu)化的PCR條件，分別對(duì)各菌種基因組DNA(HB、PG1、PM、PG2、BST-7、Y-goat、Mccp、MB和BST-7）進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將純培養(yǎng)物稀釋至濃度為108cfu/mL、107cfu/mL、106cfu/mL和105cfu/mL，分別進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，凝膠電泳觀察結(jié)果。將PG1和HB株的基因組DNA等比例混合加入體系中，檢測(cè)混合感染情況下該方法的敏感性。

1.8 臨床病料樣品檢測(cè) 提取病原培養(yǎng)鑒定為M.bovis陽(yáng)性病料的基因組DNA，用本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)并與培養(yǎng)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 退火溫度的優(yōu)化 將退火溫度分別設(shè)為47℃、52℃和57℃進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度為47℃和57℃時(shí)，在240 bp左右處擴(kuò)增出一條非特異性片段。退火溫度為52℃時(shí)，針對(duì)M.bovis的528 bp片段和針對(duì)MmmSC的270 bp片段擴(kuò)增效率較高且無(wú)雜帶。因此，最佳退火溫度確定為52℃(圖1）。

2.2 特異性試驗(yàn) 以優(yōu)化的退火溫度檢測(cè)該方法對(duì)PM、PG2、BST-7、Y-goat、Mccp、MB、Y-98的特異性。結(jié)果顯示：PG1和HB均擴(kuò)增出特異性片段，PM、PG2、BST-7、Y-goat、Mccp、MB、Y-98均無(wú)擴(kuò)增片段。表明該方法對(duì)MmmSC和M.bovis特異性良好，與其它病原無(wú)交叉反應(yīng)(圖2）。

2.3 敏感性試驗(yàn) 單一模板情況下，該方法可以檢測(cè)出HB株基因組DNA和PG1株基因組DNA最低濃度分別為106cfu/mL和105cfu/mL；混合模板情況下，可以檢出最低濃度分別為106cfu/mL的各基因組 DNA(圖 3）。

2.4 臨床病料的檢測(cè) 應(yīng)用本方法檢測(cè)臨床病料樣品，并將檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)鑒定結(jié)果相比較。結(jié)果顯示，該雙重PCR鑒定結(jié)果與病原培養(yǎng)鑒定結(jié)果符合率為100%(表2）。證明本方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出病料中的M.bovis和MmmSC，可代替病原培養(yǎng)鑒定應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。

表2 雙重PCR與病原培養(yǎng)符合試驗(yàn)Table 2 The coincidence test of duplex-PCR and culture tests

3 討論

M.bovis常與其它病原體混合感染，但實(shí)驗(yàn)室做常規(guī)病原學(xué)診斷時(shí)，由于M.bovis需要特殊培養(yǎng)基，如果不做特殊要求，一般不檢測(cè)M.bovis，這可能是M.bovis流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)與實(shí)際發(fā)病情況不符的原因。M.bovis可引起犢牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和關(guān)節(jié)炎[7-8]，臨床癥狀及病理變化與牛肺疫相似[3]。兩者存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，這給無(wú)牛肺疫認(rèn)證進(jìn)程造成嚴(yán)重干擾。因此，需要建立一種高特異性、高敏感性的快捷鑒別檢測(cè)方法。

多重PCR具有高效、快捷、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病原學(xué)診斷[9-10]。Foddai等建立了檢測(cè)無(wú)乳支原體和M.bovis的多重PCR方法，證明多重PCR方法可以被應(yīng)用于M.bovis的檢測(cè)[11]。因此，逐步建立可同時(shí)檢測(cè)多種病原的多重PCR方法是牛呼吸道相關(guān)傳染病病原鑒別診斷的發(fā)展方向之一。本實(shí)驗(yàn)建立了可同時(shí)鑒別檢測(cè)M.bovis和MmmSC的雙重PCR方法，敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明該方法敏感性較高，而且可以在PG1和M.bovis混合感染時(shí)檢測(cè)出最低菌體拷貝數(shù)為106cfu/mL的培養(yǎng)物。本方法與MmmLC、Mccp代表株、結(jié)核桿菌、無(wú)乳支原體和巴氏桿菌均無(wú)交叉反應(yīng)，證明該方法的特異性良好。PCR檢測(cè)臨床病料試驗(yàn)結(jié)果與病料培養(yǎng)鑒定結(jié)果完全符合，表明該方法能夠準(zhǔn)確鑒別檢測(cè)M.bovis和MmmSC，可應(yīng)用于臨床診斷。本研究建立的雙重PCR方法能夠縮短病原診斷周期，提高臨床檢測(cè)的工作效率，為我國(guó)M.bovis病診斷和無(wú)牛肺疫認(rèn)證提供技術(shù)支持。

[1]Pfutzner H,Sachse K.Mycoplasma bovisas an agent of mastitis,pneumonia,arthritis and genital disorders in cattle[J].Rev Sci Tech,1996,15(4）:1477-1494.

[2]Hale H H,Helmboldt C F,Plastridge W N,et al.Bovine mastitis caused by aMycoplasmaspecies[J].Cornell Vet,1962,52:582-591.

[3]Maunsell F P,Donovan G A.Mycoplasma bovisinfections in young calves[J].Vet Clin Food Anim,2009,25:139-177.

[4]辛九慶，李媛，郭丹，等.國(guó)內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(9）：661-664.

[5]Dedieu L,Mady V,Lefever P C.Development of a selective polymerase chain reaction assay for the detection ofMycoplasma mycoidessubsp.mycoides SC(contagious bovine pleuropneumonia agent）[J].Vet Microbiol,1994,42:327-339.

[6]李媛，董惠，辛九慶，等.牛霉形體PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39(05）：416-420.

[7]Nicholas R A J,Ayling R D.Mycoplasma bovis:disease,diagnosis,and control[J].Res Vet Sci,2003,74:105-112.

[8]Walz P H,Mullaney T P,Render J A,et al.Otitis media in preweaned Holstein dairy calves in Michigan due toMycoplasma bovsi[J].J Vet Diagn Invest,1997,27:117-122.

[9]Markoulatos P,Georgopoulou A,Siafakas N,et al.Laboratory diagnosis of common herpesvirus infections of the central nervous system by a M-PCR assay[J].J Clin Microbiol,2001,39:4426-4432.

[10]朱呂昌.豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌復(fù)合PCR檢測(cè)方法以及豬胸膜肺炎放線桿菌PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立[D].碩士論文，江蘇：揚(yáng)州大學(xué)，2009.

[11]Foddai A,Idini G,Fusco M,et al.Rapid differential diagnosis ofMycoplasma agalactiaeandMycoplasma bovisbased on a multiplex-PCR and a PCR-RFLP[J].Mol Cell Probes,2005,19:207-212.

Establishment of a duplex-PCR assay for detecttion ofMycoplasma bovis

LIU Yang1#,LI Yuan1#,DONG Hui2,ZHANG Mei-jing1,JIANG Hai-fang1,CHEN Wei2,XIN Jiu-qing1*

(1.State Contagious Bovine Pleuropneumonia Designated Detection Laboratory,Division of Bacterial Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China;2.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150001,China）

Mycoplasma bovisis a primary agent of respiratory disease which has similar sydromes and pathology characters to the contagious bovine pleuropneumonia caused byM.mycoidessubsp.mycoides SC(MmmSC）.In this study,a duplex-PCR assay was established for the differential detection ofM.bovisandMmmSCusing primers specific toM.bovisandMmmSC,repectively.The duplex-PCR had a detection limit of 106cfu/mL forM.bovisand 105cfu/mL forMmmSC.It specifically amplified a DNA fragment of 528 bp from theM.bovisand 270 bp from theMmmSCtype strain PG1,and no PCR products were amplified from theMycoplasma agalactiaetype strain PG2,Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides LCtype strain Y-goat,M.capricolumsubsp.Capripneumoniae,M.ovipneumoniatype strain Y-98,M.hyorhinis,Pasteurella multocidaandMycobacterium.The method was applied to detect clinical samples and the results showed 100%consistence with those of the bactera culture test.

Mycoplasma bovis;Mycoplasma mycoidessubsp.mycoidesSC;duplex-PCR

S852.6

A

1008-0589(2010）08-0599-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.05

*Correspondingauthor;#Equal contributors

2009-12-07

獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(NKLVBP200809）

(本文編輯：張朝霞、楊朋欣）