顧玉寶，楊樹寶，李小為，徐 穎，欒維民

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

雞脾臟中IFN-γ和IL-2的基因表達水平研究

顧玉寶，楊樹寶，李小為，徐 穎，欒維民*

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118）

為了解雞在胚胎期以及出殼后的機體免疫狀態(tài)，本研究采用SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法，檢測雞在胚胎時期和出殼后(1日齡～35日齡）脾臟中IFN-γ和IL-2 mRNA表達水平，并研究雞脾臟免疫功能的建立情況。研究發(fā)現(xiàn)：雞脾臟中IFN-γ和IL-2的基因表達最早于13胚齡被檢測到，隨后迅速升高，分別于出殼后7日齡和10日齡達到峰值。出殼后，雞脾臟中同一種細胞因子的基因表達水平顯著高于胚胎時期。研究還表明：IFN-γ和IL-2的基因表達模型與出殼后雞脾臟的發(fā)育以及T細胞的遷移定殖情況相一致。該研究對從分子水平，進一步了解雞在胚胎時期和出殼后，脾臟免疫功能的建立情況具有重要意義。

實時熒光定量PCR；γ-干擾素；白細胞介素- 2；基因表達；雞脾臟

雞脾臟作為雞體內(nèi)最大的外周免疫器官，在激發(fā)免疫應(yīng)答、抵抗外界抗原等方面發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)：在胚胎期和出殼初期，雞脾臟等外周免疫器官發(fā)育過程中，從胸腺遷移定殖的T細胞，會出現(xiàn)3次波峰[1-2]。這種現(xiàn)象發(fā)生在胸腺造血細胞增殖之后[1-3]。這3次T細胞的遷移波峰分別發(fā)生在15胚齡～20胚齡，21胚齡～6日齡，7日齡～9日齡。在胚胎時期，雞脾臟中T細胞的數(shù)量增長緩慢，而在出殼初期則迅速增長[2]。另外雞在胚胎期和出殼初期，脾臟的組織結(jié)構(gòu)也存在顯著差異[4]。20胚齡時，雞脾臟中才開始出現(xiàn)特異性結(jié)構(gòu)，直至7日齡時，脾臟的結(jié)構(gòu)才接近成年雞水平。而上述這些差異都與胚胎期和出殼后雞脾臟的重量增長呈明顯的正相關(guān)性。

已有眾多學者從細胞水平對雞脾臟進行了深入的研究。這些研究表明：脾臟作為外周免疫器官，其免疫功能從胚胎時期開始不斷增強，在7日齡～8日齡時達到成年水平[4-5]。機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟與日齡之間的正相關(guān)性也在哺乳動物的相關(guān)研究中得到證實[6-7]。而從分子水平對健康雞脾臟免疫功能的建立情況的研究，卻鮮有報道。

本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測雞在胚胎期和出殼后(1日齡～35日齡）脾臟中IFN-γ和IL-2的基因表達情況，對于更深入了解雞在胚胎期以及出殼后的機體免疫狀態(tài)具有重要意義，同時為出殼初期雞群的適時免疫和疾病防治等相關(guān)研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 實驗用海蘭白雞種蛋購自長春銀河養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑及儀器 SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ試劑盒(A.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑B.PCR反應(yīng)試劑）、RNAisoTMPlus購自寶生物工程(大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中登錄的雞β-actin mRNA(X00182），IFN-γ mRNA(X99774）及IL-2 mRNA(AF000631）保守序列分別設(shè)計1對引物，引物由寶生物工程(大連）有限公司合成(表1）。

表1 擴增雞IFN-γ、IL-2和β-actin基因片段的引物Table 1 Primers used in RT-PCR assay for chicken IFN-γ,IL-2 and β-actin genes

1.4 實驗設(shè)計 將300枚實驗用海蘭白種蛋置于孵化器中，在37.8℃、65%相對濕度，轉(zhuǎn)蛋角度為90°/2 h的條件下孵育。雛雞出殼后常規(guī)飼養(yǎng)。第一周室溫控制在34℃，相對濕度70%，隨著雛雞日齡的增加，室溫每周降低3℃至恒定在24℃。分別在13胚齡、15胚齡、18胚齡、20胚齡和出殼后1日齡、4日齡、7日齡、10日齡、14日齡、21日齡、35日齡，各隨機選取20只雞胚或雛雞，無菌剖取其脾臟，在液氮中保存?zhèn)溆茫糜诩毎俁NA提取。

1.4.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄用RNAisoTMPlus提取雞脾臟總RNA，操作按照產(chǎn)品說明書進行。cDNA合成按SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ試劑盒說明書操作。

1.4.2 實時熒光定量PCR擴增條件采用25 μL反應(yīng)體系：SYBRRPremixExTaqTMⅡ12.5μL，10μmol/L上、下游引物各 1 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL；cDNA 2 μL，去離子水 8 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；隨后進行95℃5 s，57℃30 s，40個循環(huán)擴增獲得β-actin、IFN-γ和IL-2基因。

1.4.3 標準品制備本實驗以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA分別作為β-actin、IFN-γ和IL-2基因的標準品，制作各自的標準曲線[8]。具體方法如下：取2 uL逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA樣本，加入18 μL EASY Dilution稀釋至樣本濃度的1×10-1，依次10倍梯度稀釋 1×10-2，1×10-3，1×10-4濃度的cDNA。每個稀釋度設(shè)3組重復，進行實時熒光定量檢測。

1.5 實驗數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行分析：各時間點之間采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行處理，確定p≤0.05為有顯著性差異。根據(jù)所得數(shù)據(jù)分別繪制柱形圖，用來反映健康雞脾臟中IFN-γ和IL-2兩種細胞因子mRNA表達量的動態(tài)變化情況。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR的標準曲線 將制備的β-actin、IFN-γ和IL-2基因的標準品采用 SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法，分別繪制各自的標準曲線。通過檢測不同熒光信號，分別得到3條標準曲線，雞β-actin mRNA的Ct值與其濃度在上述5個稀釋范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2>0.99(圖1）。

2.2 熔解曲線 β-actin熔解曲線只有單一峰型，反映擴增產(chǎn)物的特異性強(圖2）。

2.3 相對定量結(jié)果

2.3.1 胚胎時期和出殼后雞脾臟中IL-2的基因表達情況雞脾臟最早可在13胚齡檢測到IL-2的基因表達，并且在其他各日齡組均檢測到該基因的表達。與所有日齡組相比，雞脾臟中IL-2的基因表達水平在出殼后10日齡顯著增高(p≤0.05），達到峰值。出殼后7日齡時，IL-2的基因表達已達到出殼后14日齡～35日齡時的較高水平。出殼后14日齡～35日齡，雞脾臟中IL-2的基因表達水平比出殼后10日齡有顯著降低(p≤0.05），但同樣在較高水平維持動態(tài)平衡。所以，出殼后雞脾臟中IL-2的基因表達水平是胚胎發(fā)育時期的20.5倍。進一步比較發(fā)現(xiàn)，出殼后1日齡～10日齡雞脾臟中，IL-2的基因表達水平是胚胎時期平均水平的20.1倍，而出殼后14日齡～35日齡相對于胚胎時期的比值為21.3倍(圖 3A）。

2.3.2 胚胎時期和出殼后雞脾臟中IFN-γ的基因表達情況與雞脾臟中IL-2的基因表達情況相一致，IFN-γ的基因表達也同樣可以在13胚齡被檢測到。與各日齡組相比，雞脾臟中IFN-γ的基因表達在出殼后4日齡即迅速升高(p≤0.05），達到出殼后14日齡～35日齡水平。出殼后7日齡，IFN-γ的基因表達繼續(xù)顯著升高至峰值(p≤0.05）。雞脾臟中IFN-γ的基因表達于出殼后14日齡～35日齡時達到高水平的動態(tài)平衡。與IL-2表達情況相類似：出殼后雞脾臟中IFN-γ的基因表達水平是胚胎時期的10.9倍，相對于胚胎時期，出殼后1日齡～10日齡和出殼后14日齡～35日齡IFN-γ的基因表達水平分別是其11.2倍和10.6倍(圖3B）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)雞脾臟中，同一種細胞因子在胚胎時期的基因表達水平顯著低于出殼后的表達水平，特別與7日齡～10日齡的雛雞進行比較時，這種差異尤為顯著。而7日齡～10日齡的雛雞脾臟中，細胞因子的表達水平顯著提高，很可能是脾臟生理功能完善的一種指征。同時，該階段的這種顯著變化還可能與出殼初期雞脾臟中T細胞的遷移、定殖規(guī)律一致。細胞因子的基因表達所呈現(xiàn)的這種現(xiàn)象及其與組織發(fā)育之間的關(guān)聯(lián)性，已經(jīng)在Bar-Shira等對雞腸相關(guān)淋巴組織(GALT）的研究中得以確認[9]。Seto也曾發(fā)現(xiàn)：與雞胚發(fā)育期和2日齡雛雞相比，7日齡～14日齡雛雞脾臟對抗原的免疫應(yīng)答水平更高。此外，還有研究表明：與胚胎時期和出殼初期(1日齡～7日齡）相比，使用TD抗原對12日齡雛雞進行免疫接種，其脾臟產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平顯著升高[4]。

IFN-γ和IL-2基因的初始表達均在13胚齡，這與Zhang等報道的使用病毒抗原對不同胚齡雞胚進行免疫接種時，小于14胚齡的雞胚只能發(fā)生免疫耐受，而無法產(chǎn)生免疫應(yīng)答的結(jié)果相吻合[10]。同時本研究表明：雞胚發(fā)育到18胚齡時，脾臟生理功能已發(fā)育成熟而且具備免疫應(yīng)答能力。但與Sharma等報道的略有不同[11]：此時脾臟中細胞因子的基因表達水平仍然相對較低。這很可能因為：雞胚在抗原刺激下，機體的淋巴組織能夠快速誘導細胞因子的基因表達。雞脾臟中T細胞的遷移，定殖起始于15胚齡。而在此之前，細胞因子可能來自NK細胞或巨噬細胞等其他細胞。Gobel等報道NK細胞最早于8胚齡在雞脾臟中出現(xiàn)，其數(shù)量在14胚齡達到峰值[12]。細胞因子的基因在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞內(nèi)得以表達，因為這些細胞最早在10胚齡出現(xiàn)[13]。Seto也曾報道：雞在胚胎時期和出殼初期，使用鼠血紅細胞對其進行免疫，隨后網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞發(fā)生顯著增殖。而巨噬細胞正是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的重要組成之一。因此某些細胞因子很可能是由胚胎時期雞脾臟中的巨噬細胞所表達的。

本研究在國內(nèi)首次采用實時熒光定量PCR方法，研究雞在胚胎時期和出殼后(1日齡～35日齡）脾臟中具有代表性的細胞因子：IFN-γ和IL-2的基因表達情況，為進一步系統(tǒng)地從分子水平研究健康雞脾臟免疫功能的建立情況奠定基礎(chǔ)。

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The expression level of gamma-interferon and interleukin-2 genes in chicken spleen

GU Yu-bao,YANG Shu-bao,LI Xiao-wei,XU Ying,LUAN Wei-min*

(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China）

In the present study,the ontogeny of the chicken spleen immune function was investigated by quantitative analysis of chicken IFN-γ and IL-2 mRNA in the chicken spleen during embryogenesis and the posthatch period(day 1 to day 35）using SYBR Green I based real-time RT-PCR method.The results showed that expression of IFN-γ and IL-2 genes in the spleen became detectable as early as 13 day old embryo,then increased gradually and peaked by 7 days and 10 days posthatch respectively.Expression of cytokine genes were also higher in the spleen of posthatch chickens compared with chick embryos.This expression pattern was in accordance with the completion of T-cell colonization and structural development of the spleen during the posthatch period.

real-time RT-PCR;IFN-γ;IL-2;gene expression;chicken spleen

S852.723：Q786

A

1008-0589(2010）08-0611-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.08

*Correspondingauthor

2009-09-22

國家自然科學基金資助項目(30771557）

顧玉寶(1982-），男，遼寧鞍山人，碩士研究生，主要從事動物形態(tài)和組織學研究.

*通信作者：E-mail：luanweimin@yahoo.com.cn

(本文編輯：陳立群）