王海霞李金枝解其貴楊瑜董凌云左緒磊

(1.復旦大學附屬金山醫(yī)院婦產科,上海 200540;2.復旦大學附屬公共衛(wèi)生中心科研部,上海 201508)

滋養(yǎng)層細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

王海霞1李金枝1解其貴1楊瑜2董凌云1左緒磊1

(1.復旦大學附屬金山醫(yī)院婦產科,上海 200540;2.復旦大學附屬公共衛(wèi)生中心科研部,上海 201508)

目的:培養(yǎng)符合實驗要求的人絨毛滋養(yǎng)層細胞。方法:胰蛋白酶、膠原酶消化絨毛組織,進行原代培養(yǎng),用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)并純化。觀察其形態(tài)學特征并繪制生長曲線,計算倍增時間。應用光鏡、免疫熒光進行細胞鑒定。Transwell小室法檢測其體外侵襲能力。結果:原代培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞24h貼壁,7～10d首次傳代,倍增時間3.42d,細胞表達細胞角蛋白7而不表達波形蛋白。結論:胰蛋白酶、膠原酶消化法可獲得符合實驗要求的人絨毛滋養(yǎng)層細胞,能建立穩(wěn)定的人絨毛滋養(yǎng)層細胞體外培養(yǎng)體系。

滋養(yǎng)層細胞; 體外培養(yǎng)

AbstractObjective:To culture human first trimester cytotrophoblasts in vitro.Methods:Human first trimester cytotrophoblasts were isolate,purify and culture.The morphology characteristics were detected through microscopy,we drew growth curve and calculated the doubling time to describe its growth characteristics.Immunofluorescence was carried out to determined the expression of cytokine7and vimintin.Results:The cells adherence achieved24-48hours after seeding,7-10days later the cells were subcultured for the first time.The doubling time of cell population was3.4days.The cell populations expressed cytokeratin7but not vimentin.Transwell invasion experiment showed that the invasive capability remained in vitro.Conclusions: Typsin-collagenase digestion process can obtain human trophoblastic cells and also can establish a stable human trophoblastic cells culture systerm in vitro.

Key WordsFirst trimester cytotrophoblasts; In vitro

目前,對人絨毛滋養(yǎng)層細胞的生物學行為及機制的體外研究越來越多,而人絨毛滋養(yǎng)細胞的原代培養(yǎng)是進行這類研究的基礎。本研究對前人的方法進行了比較、優(yōu)化,試圖建立一種簡便、有效的人絨毛滋養(yǎng)層細胞原代培養(yǎng)方法。

1 資料與方法

1.1 組織來源 取復旦大學附屬金山醫(yī)院婦產科計劃生育門診自愿終止妊娠婦女,自愿捐贈的標本10份,標本為妊娠45～56d、乙型肝炎6項檢查均陰性孕婦的胎盤絨毛組織。標本取得經本院倫理委員會同意,患者同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司,胰酶購自 Gibco公司,膠原酶、Ficoll購自Sigma公司,小鼠抗人細胞角蛋白7(cytokeratin7)、波形蛋白(vimentin)均購自Santa Cruz公司,Alexa594-兔抗鼠 IgG和DAPI均購自Sigma公司,Metrigel購自BD公司,Transwell購自Corning Costar公司,培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿購自Corning公司,其他試劑(如臺盼蘭、多聚甲醛、PBS、Tween、TritonX100、結晶紫)為常規(guī)國產試劑。

1.3 早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞原代培養(yǎng) 取妊娠45～56d發(fā)育正常的人工流產新鮮胎盤絨毛組織,參照Nagamatsu等[1]方法分離、培養(yǎng)人絨毛外滋養(yǎng)細胞,置于含有雙抗的(100U·mL-1青霉素和100μg· mL-1鏈霉素)的無血清RPMI1640培養(yǎng)液中,快速冰上運送至超凈工作臺內,PBS沖洗3次,剪去胎膜組織及蛻膜組織,挑取絨毛組織,充分剪碎至糊狀,加0.1%胰酶和1mg·mL-1的膠原酶,37℃靜置消化30min,吹打后吸出細胞懸液,用含10%胎牛血清(FBS)、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液終止消化,200目篩網過濾,將所得懸液與Ficoll細胞分離液,以1:1加入15mL離心管中,以1 200g離心30min,離心結束后離心管內上下兩層液面交界處云霧狀灰白層即為絨毛外滋養(yǎng)層細胞,小心吸取后用含10%FBS的1640培養(yǎng)液清洗2次,最后用含10%FBS的1640培養(yǎng)液在37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后換液。

1.4 絨毛滋養(yǎng)層細胞的傳代與純化 當細胞長滿培養(yǎng)皿的80%以上或局部區(qū)域因細胞接觸抑制或融合而停止生長時,進行傳代。用含0.25%EDTA的胰酶,37℃消化1～3min,鏡下觀察到有部分細胞變圓、脫落時,用含10%FBS的RPMI1640終止,去除脫落細胞。剩余細胞用PBS洗1次,再次用含0.25%EDTA的胰酶消化至所有細胞均變圓脫落,用含15%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液終止后吹打混勻,以1×105·mL-1接種于新培養(yǎng)皿中。上述方法傳代直至鏡下觀察細胞為較均一的上皮樣形態(tài)。

1.5 絨毛滋養(yǎng)層細胞的生長特點 取2～3代對數(shù)生長期的絨毛滋養(yǎng)細胞,消化、計數(shù),用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×104· mL-1,充分混勻后,以1mL/孔接種到24孔板中,次日起每24h消化計數(shù)其中3孔,根據計數(shù)結果繪制細胞生長曲線,并依據以下公式計算倍增時間: TD=T×㏒2/㏒(N/N0)。

1.6 絨毛滋養(yǎng)層細胞免疫鑒定 滋養(yǎng)層細胞爬片培養(yǎng)48h后,用PBS洗滌3次,每次5min,多聚甲醛室溫固定15min,用PBS洗3次,含0.2%TritonX100的PBS室溫通透5min,PBS洗3次,1%兔血清室溫封閉1h,一抗4℃孵育過夜(cytokeratin7和vimentin均1:100稀釋),用0.1%PBS洗3次,二抗1:200,DAPI1:1000稀釋,室溫同時孵育1 h,PBS洗3次,抗淬滅甘油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。低倍鏡下取3個視野,計算其純度。

1.7 絨毛滋養(yǎng)層細胞體外侵襲能力測定 Metrigel原液用PBS10倍稀釋,取40μL加入Transwell小室內面,37℃凝固4h。細胞消化計數(shù),以無血清的培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×106·mL-1,將涂有Metrigel的Transwell置24孔板中,上室加入上述備好的細胞懸液0.1mL,下室加入含10%FBS的培養(yǎng)液0.6mL,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h取出。擦去上室細胞,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色,沖洗后晾干,判斷絨毛滋養(yǎng)層細胞穿透基底膜的能力。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 細胞24h貼壁,48～72h完全鋪展開,細胞大,呈略不規(guī)則的圓形或橢圓形,細胞核相對較小,胞漿豐富,高倍鏡下見胞膜上有豐富的微絨毛和突起。顯示絨毛滋養(yǎng)層細胞特征,見圖1A。繼續(xù)培養(yǎng)1～2d,部分區(qū)域細胞自發(fā)聚集成簇發(fā)生融合,融合的細胞間連接緊密,胞核向中央集中,停止生長,顯示向合體滋養(yǎng)層細胞(syncytiotrophoblast,ST)分化的趨勢,見圖1B。

圖1 絨毛滋養(yǎng)層細胞的形態(tài)學觀察(A)細胞接種后48～72h(×100);(B)部分細胞聚集融合(×100);(C)細胞完全長滿,單層生長(×40)。

2.2 絨毛滋養(yǎng)層細胞的體外生長特性 初次培養(yǎng)7～10d,局部細胞接觸融合,停止生長。此時予消化傳代,傳代后24h換液,去除死亡細胞,大部分細胞可以耐受胰酶消化,貼壁良好。傳代后細胞呈短梭形或多邊形,單層生長,失去相互融合特性,見圖1(C)。一般可傳代7～8次,2次傳代間隔為3～4 d。取第2～4代對數(shù)生長期的細胞做生長曲線,連續(xù)計數(shù)8d,結果顯示,細胞飽和密度為2.57×105·mL-1,倍增時間3.42d。生長曲線見圖2。

圖2 人絨毛細胞體外生長曲線

2.3 免疫熒光檢測抗原表達情況 cytokeratin7陽性細胞顯示為胞漿中紅色熒光,細胞核經DAPI染色后顯示為藍色。絕大部分細胞cytokeratin7表達陽性,vimentin為陰性,表明經分離純化得到的細胞為人絨毛滋養(yǎng)層細胞,純度為92%。

2.4 人絨毛體外侵襲能力 體外侵襲實驗顯示細胞能夠穿透細胞外介質膠(Metrigel),遷移到達小室外表面,表明體外培養(yǎng)的人絨毛滋養(yǎng)層細胞仍能夠保持其侵襲能力(圖3)。

圖3 Transwell侵襲實驗(×100)

3 討 論

人絨毛滋養(yǎng)層細胞體外培養(yǎng)常見的方法有組織帖塊法、胰酶-膠原酶混合消化法,胰蛋白酶-DNA酶消化法、單純胰酶消化法等[1-4]。組織消化法原代細胞生長周期長,容易混雜成纖維細胞及其他間質細胞,純度不夠。單純胰酶消化法作用時間長,往往需要反復消化,獲得細胞量少,加入DNA酶后消化速度明顯增加,但細胞損傷亦增加,細胞活性較差。而胰酶-膠原酶則相對溫和,可以獲得較多有活力的細胞。本研究對多種培養(yǎng)方法進行了比較,最終選擇胰酶-膠原酶一次性靜置消化法,因反復消化或消化過程中反復振蕩都會對細胞造成不同程度的損傷,且費時費力。膠原酶可以分解間質細胞,有效減少成纖維細胞污染。本實驗分離出來的細胞并未以消化法、貼壁法等進行純化,仍可獲得滿意的細胞純度,也證實了這一點。對于滋養(yǎng)層細胞的分離,不少人采用percoll梯度離心法[5],但后來有研究者[6]將percoll與Ficoll進行比較后發(fā)現(xiàn)兩者的分離效果無明顯差異,而后者省去了繁瑣的配制過程,應用更加簡便。故本研究采用Ficoll進行分離。

細胞鑒定是培養(yǎng)細胞不可缺少的環(huán)節(jié),最常用的鑒定方法是形態(tài)學和免疫學方法。通常情況下,離體培養(yǎng)的上皮來源細胞呈扁平的多角形,呈片狀鋪展生長。本實驗所獲得的細胞形態(tài)與之相符。目前對于鑒定滋養(yǎng)層細胞的分子標記尚無統(tǒng)一的標準,比較認同的是細胞角蛋白7(cytokeratin7)、波形蛋白(vimentin)?？菇堑鞍卓贵w是目前應用最為廣泛的鑒定分離純化的滋養(yǎng)層細胞的指標。然而, Blaschitz等[7]報道,不同類型的細胞角蛋白和廣譜的細胞角蛋白并不具有滋養(yǎng)層細胞特異性,大多數(shù)抗細胞角蛋白抗體都既可與滋養(yǎng)層細胞反應,又可與絨毛間質細胞結合。在被檢測的13個抗細胞角蛋白抗體中,僅抗cytokeratin7抗體對滋養(yǎng)層細胞是特異性的。Frank等[8]也發(fā)現(xiàn),在人胎盤子宮基質細胞中可表達多種細胞角蛋白,cytokeratin7對于滋養(yǎng)層細胞的特異性最強,推薦用于鑒別滋養(yǎng)層細胞。波形纖維蛋白在成纖維細胞、子宮基質細胞等間質細胞中表達陽性,而在滋養(yǎng)層細胞中則呈陰性,因此可借以將滋養(yǎng)細胞與間質細胞等區(qū)分開來。本試驗通過免疫熒光證實,所分離培養(yǎng)的細胞絕大部分為滋養(yǎng)層細胞,純度較高。

本研究結果顯示,細胞經7～10d培養(yǎng)后可進行初次傳代,與部分文獻報道略有出入,考慮與計數(shù)誤差及接種密度有關。連續(xù)細胞計數(shù)得到細胞倍增時間為3.42d,表明滋養(yǎng)層細胞在體外仍具有良好的增殖能力,且可以穩(wěn)定傳代5～6次,足以滿足進一步的研究需要。妊娠成功與維持依賴于滋養(yǎng)層細胞的侵襲功能。胚胎的著床需要胚胎對子宮內膜上皮細胞識別、定位并與其粘附,然后穿透子宮內膜表面,植入子宮內膜基質中。胚胎植入后,外周的滋養(yǎng)層細胞迅速分化為內層的細胞滋養(yǎng)層細胞和外層的合體滋養(yǎng)層細胞,細胞滋養(yǎng)層細胞增生活躍,具有侵襲功能,而外周的合體滋養(yǎng)層細胞無侵襲能力。胎盤形成的一個重要生理變化就是細胞滋養(yǎng)層細胞侵入子宮內膜的螺旋動脈,破壞動脈壁,使動脈管腔擴大,這一過程的順利完成有賴于絨毛外滋養(yǎng)層細胞的正常侵襲,而滋養(yǎng)層細胞的侵襲則受到細胞因子、粘附分子、細胞外基質和蛋白水解酶及其組織抑制物等多種因素的調控。因此,體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞仍保持其侵襲能力是我們進行實驗研究的基礎。本實驗結果顯示,滋養(yǎng)層細胞在體外培養(yǎng)時能夠穿透模擬基底膜,即仍保持了其侵襲遷移能力,故可以用作有關其侵襲機制及調控的研究。

根據以往的文獻報道,不同的分離條件可以獲得不同種類的滋養(yǎng)層細胞,從而分別對其特性進行研究。然而,本研究通過觀察培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞特性可以看出,細胞滋養(yǎng)層細胞在體外可以自發(fā)融合為合體滋養(yǎng)層細胞,而合體滋養(yǎng)層細胞經消化傳代則失去其融合特性,呈單層生長,且可以達到較高密度。故動態(tài)的研究觀察可能亦具有重要意義。

(致謝:感謝金山醫(yī)院中心實驗室范衛(wèi)、史繼敏和張繼紅對本實驗的大力支持與幫助。)

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5 白菡,何麗霞,馬力,等.人早孕絨毛膜滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)模型的建立[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2006,15(3):319-322.

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Isolation and Differentiation of Human First Trimester Trophoblasts

WA N G Haixia1L I J inzhi1X I E Qigui1YA N G Yu2DON G L ingyun1ZUO X ulei11.Department of Obstetrics and Gynecology, J inshan Hospital,Fudan University,S hanghai 200540,China;2.Scientif ic Research Center,S hanghai Public Health Clinical Center S hanghai 201508,China

Q813.1+1

A

左緒磊,E-mail:xulei_zuo@hotmail.com