鄭銳年 張為民 王曉懷 高慧潔

肺癌是腫瘤中威脅人類生命健康的頭號殺手，70%患者在診斷時已是局部晚期或有遠處轉移。第三代化療藥物與鉑類的聯(lián)合化療是晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的標準治療，存在的問題是療效到達平臺：有效率為25%-35%，中位生存期為8個月-10個月。以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）及其細胞信號轉導為靶點的肺癌靶向治療雖不良反應小，但其有效性與EGFR基因突變有關，總體人群有效率低，且中位耐藥時間為8個月-10個月?；熍c抗血管生成等靶向藥物聯(lián)合治療亦僅延長生存1個月-3個月。因此，尋找高效、低毒的治療肺癌新方法是醫(yī)學界面臨的重要問題。

聲動力療法（sonodynamic, SDT）是在光動力療法（photodynamic therapy, PDT）基礎上發(fā)展起來的一種腫瘤治療新理念、新方法。其機制是口服或靜脈注射聲敏劑，聲敏劑通過血流特異性在腫瘤細胞內聚集，然后用一定頻率和強度的超聲波照射腫瘤位置，通過聲能激活聲敏劑，使其產生一系列化學反應（如產生單態(tài)氧），導致腫瘤細胞的不可逆性損傷[1,2]。與光動力療法（激光激活光敏劑，產生單態(tài)氧或者自由基，從而起到抗腫瘤作用）相比，超聲對人體組織有很強的無創(chuàng)穿透能力，無需借助其他介入手段即可對深部腫瘤進行治療，故有著廣闊的發(fā)展前景。雖大量的臨床前基礎研究顯示SDT可高效特異殺傷腫瘤[3-5]，目前SDT尚未被批準用于臨床的主要原因之一是既往采用的聲敏劑是血卟啉類的光敏劑，該類光（聲）敏劑不但腫瘤特異性差，而且在正常組織內排泄慢，注射后需避光近1個月。因此，近年來SDT的研究多集中于發(fā)掘新型聲敏劑。遺憾的是，大多數(shù)聲敏劑仍未能解決兩大問題：腫瘤的特異性及非腫瘤組織清除率，故仍未適用于人體。

二氫卟吩（Chlorin e6）是一種結構類似于血卟啉的葉綠素降解產物。1974年Yamamoto[6]首次采用激光輻照Chlorin e6光動力治療艾氏細胞瘤，殺傷作用明顯。之后其光動力抗腫瘤效應經大量的動物實驗得到證實，且具低毒、腫瘤特異性聚集高、正常組織清除快、光毒副作用低的優(yōu)點[7-9]，是一個具有誘人前景的光敏劑，Chlorin e6已完成I期臨床試驗光動力治療黑色素瘤皮膚轉移瘤[10]。鑒于多數(shù)光敏劑亦同時具聲動力作用，本研究利用頻率1.0 MHz的超聲激活Chlorin e6，觀察Chlorin e6聲動力對人肺腺癌SPCA-1細胞生長的抑制作用，旨在探索Chlorin e6作為聲敏劑治療NSCLC的可能。

1 材料與方法

1. 1 主要材料

1.1.1 細胞系 人肺腺癌細胞SPCA-1細胞株由中科院上海細胞生物學研究所提供。正常人外周血單核細胞（normal peripheral mononuclear cell, PMNC）細胞株通過COBE spectra血細胞分離機收集于35歲健康成人自愿者。

1.1.2 主要試劑和儀器 四甲基偶氮唑鹽（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT）及二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）購于Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)液、小牛血清均為Gibco產品。Chlorin e6由EEC Bio-Tech Co. Ltd （廣州）公司提供。其分子結構為：Sodium13-carboxy-17-[2-carboxyethyl]-15-carboxymethyl-17,18-trans-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2, 7, 12, 18-tetramethyl-porphyrin（圖1A）。Chlorin e6是一種光敏劑，經我們檢測Chlorin e6在400 nm和653 nm（可見紅光區(qū)）處有兩個吸收峰（圖1B），與國外報道的一致[11]。酶標儀為澳大利亞Biocell lt-2產品。倒置顯微鏡為日本Olympus產品。超聲治療儀由北京天使公司提供（頻率為1.0 MHz，聲強為0.1 W/cm2-2.2 W/cm2）。COBE spectra血細胞分離機為美國GAMBRO. BCT公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞SPCA-1置于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，5%CO2培養(yǎng)箱37oC培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，每次實驗前取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，經胰蛋白酶（Invitrogen公司）/乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）消化液消化后備用。PMNC細胞由血細胞分離機收集后將其置于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，5%CO2培養(yǎng)箱37oC培養(yǎng)，24 h內備用。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 取0.5 mL對數(shù)生長期SPCA-1細胞（2.5×105/mL）和24 h內備用的PMNC（1.0×106/mL），移入2 mL凍存管，按不同的實驗要求加入不同濃度Chlorin e6，孵育45 min，將凍存管浸入盛有蒸餾水的容器中，超聲平面探頭置于凍存管底部外相距2 mm處，超聲輻照60 s后（圖2），將細胞懸液按每孔100 μL移入96孔板（每組3個平行復孔），之后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每孔加入MTT（5 g/L），培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，用自動酶標儀檢測在570 nm波長下各孔光密度值（optical density, OD），細胞存活率（%）=（OD實驗組/OD對照組）×100%。實驗重復6次。

圖 1 Chlorin e6的結構圖以及紫外-可見光吸收光譜Fig 1 the structure diagram and absorbance spectra of chlorin e6 A: structure diagram; B: absorbance spectra.

圖 2 超聲輻照實驗裝置圖Fig 2 Ultrasonic exposure system

圖 3 超聲（A）及Chlorin e6（B）對SPCA-1及PMNC細胞生長的影響Fig 3 Effects of ultrasound (A) and Chlorin e6 (B) on the proliferation of SPCA-1 and PMNC cells

圖 4 超聲聯(lián)合Chlorin e6聲動力對SPCA-1（A）及PMNC（B）細胞生長的影響Fig 4 the sonodynamic effects, using chlorin e6 as a sonosensitizing agent activated by ultrasound, on the proliferation of SPCA-1 and PMNC cells

1.2.3 細胞形態(tài)變化的觀察 倒置顯微鏡觀察細胞存活情況：每孔隨機選擇1個高倍視野（×400），計算每個高倍鏡視野死亡細胞的百分數(shù)。細胞死亡率（%）=（每個高倍視野死細胞數(shù)/每個高倍視野總細胞數(shù)）×100%。

1.2.4 實驗分組 超聲頻率固定為1.0 MHz，超聲輻照時間固定為60 s。各組處理后6 h測細胞活性及觀察細胞形態(tài)。超聲組：聲強設定為0 W/cm2（對照組）、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、1.5 W/cm2、2.0 W/cm2；Chlorin e6組：Chlorin e6濃度設定為0mg/mL（對照組）、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL；聲動組：聲強設為1.0 W/cm2，分為對照組（C）、超聲組（U1.0）、Chlorin e6 0.2 mg/mL組（E0.2）、超聲+Chlorin e6組（U1.0 E0.05、U1.0 E0.1、U1.0 E0.2）。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進統(tǒng)計學分析，實驗結果以Mean±SD表示，相關各組間采用One-way ANOVA檢驗，Ρ＜0.05判定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 超聲及Chlorin e6對細胞生長的影響 1.0 MHz超聲（1.0-2.0）W/cm2×60 s呈強度依賴性抑制SPCA-1和PMNC細胞生長（圖3A），超聲抑制50%SPCA-1和PMNC細胞生長的強度分別為：1.45 W/cm2、1.44 W/cm2，無統(tǒng)計學差異（Ρ＞0.05）。Chlorin e6（0.4-3.2）mg/mL呈濃度依賴性地抑制SPCA-1和PMNC細胞生長（圖3B）。Chlorin e6抑制SPCA-1和PMNC細胞生長的IC50值分別為：0.79 mg/mL、0.97 mg/mL，無統(tǒng)計學差異（Ρ＞0.05）。

2.2 超聲與Chlorin e6聯(lián)合作用對細胞生長的影響 1.0 W/cm2單純超聲作用時，SPCA-1和PMNC細胞存活率分別為79.6%、78.1%，與正常對照組相比，均有統(tǒng)計學差異（Ρ＜0.05），SPCA-1和PMNC細胞間比較無統(tǒng)計學差異（Ρ＞0.05）。圖4所示，0.05 mg/mL、0.1 mg/mL和0.2 mg/mL三個不同濃度Chlorin e6單純作用對SPCA-1和PMNC細胞生長均無明顯作用（Ρ＞0.05）； 1.0 W/cm2超聲聯(lián)合該三個不同濃度Chlorin e6作用時，SPCA-1細胞存活率分別為66.1%、53.0% 和28.0%，PMNC細胞存活率分別為78.7%、80.5% 和75.2 %。與單純超聲和Chlorin e6相比，超聲聯(lián)合Chlorin e6對SPCA-1細胞生長的抑制有統(tǒng)計學差異（Ρ＜0.05），對PMNC細胞存活率無統(tǒng)計學差異（Ρ＞0.05）。

2.3 倒置顯微鏡觀察超聲與Chlorin e6單獨及聯(lián)合作用對SPCA-1細胞存活的影響 高倍鏡下，圓形、透亮、胞膜完整、胞漿豐富的細胞視為活細胞；多形、不透亮、胞膜破裂、胞漿流失的細胞視為死細胞（圖5）。C組、U1.0組、E0.2組、U1.0E0.2組SPCA-1細胞死亡率分別為1.6%、22.0%、2.3%、69.8%。與單純超聲的U1.0組和單純Chlorin e6 的E0.2組比，超聲聯(lián)合Chlorin e6的U1.0E0.2組SPCA-1細胞死亡率明顯升高（Ρ＜0.05）。

圖 5 倒置顯微鏡觀察超聲、Chlorin e6單獨及聯(lián)合聲動力治療對SPCA-1細胞存活影響（×400）Fig 5 Morphological analysis of SPCA-1 cell survival induced by ultrasound and chlorin e6 alone or combination treatment (×400)

3 討論

本研究首次將已證實具低毒、腫瘤特異性聚集高、正常組織清除快、光毒副作用低等優(yōu)點的光敏劑Chlorin e6作為聲敏劑對NSCLC細胞進行聲動力研究，結果顯示，1.0 MHz頻率超聲強度1.0 W/cm2-2.0 W/cm2作用60 s強度依賴性地抑制SPCA-1和PMNC細胞生長，說明一定頻率和強度的超聲不僅能損傷腫瘤細胞還能損傷正常細胞，與國內外報道相同[12-14]。其抑制50%SPCA-1和PMNC細胞生長的超聲強度相似，說明超聲對NSCLC細胞和正常單核細胞的損傷無明顯差別，這與既往超聲對其他腫瘤的研究不同。既往研究顯示，腫瘤細胞相比正常細胞更易受超聲損傷[12]：人肺癌、乳腺癌以及黑色素瘤細胞相比人包皮成纖維細胞以及人羊水膜上皮細胞更易受超聲損傷[13]，成人T細胞白血病MT-2細胞相比正常人外周單核PMNC細胞更易受超聲損傷[14]。可能的原因是：既往的研究是腫瘤細胞與同源的正常細胞相比，而本研究是上皮來源的人肺腺癌SPCA-1細胞與血液系統(tǒng)的正常單核細胞PMNC相比，血液系統(tǒng)的細胞較上皮細胞對理化作用更敏感，抵消了腫瘤細胞更易受超聲損傷的作用；本研究所采用的超聲頻率與既往研究不同，不同頻率的超聲強度作用可能不同。其確切可能存在的原因有待進一步證實。

本實驗Chlorin e6濃度依賴性地抑制SPCA-1細胞生長，Chlorin e6原本是光敏劑，既往研究顯示：methylene blue、toluidine blue以及victoria blue等光敏劑均呈濃度依賴性地抑制腫瘤細胞生長[15]。本研究首次比較了Chlorin e6對腫瘤細胞和正常PMNC細胞的作用，其抑制SPCA-1及PMNC細胞生長的IC50值無明顯差別，結果說明Chlorin e6本身對SPCA-1及PMNC細胞的殺傷作用相似，對SPCA-1細胞不具有靶向性。

理論上觀察超聲聲動力作用最好選擇對正常PMNC細胞不存在損傷的超聲強度和Chlorin e6濃度。本實驗選擇0.05 mg/mL-0.2 mg/mL Chlorin e6做聲動力研究是基于此濃度范圍Chlorin e6對正常PMNC細胞不存在抑制效應，但本實驗基于以下原由選擇對正常PMNC約20%損傷的1.0 W/cm2超聲強度進行聲動力研究：1.0 W/cm2為臨床常用超聲強度[16,17]；超聲需達到一定強度產生空化效應時，才能激活聲敏劑產生抗腫瘤效應，不同的聲敏劑被激活所要求的超聲強度不同[18,19]。本研究的預實驗顯示，1.0 W/cm2超聲強度才能激活Chlorin e6產生抗SPCA-1細胞生長作用。

本實驗結果證實，超聲可以激活Chlorin e6起特異性抗腫瘤作用。相比單純超聲和Chlorin e6，超聲聯(lián)合Chlorin e6組明顯抑制SPCA-1細胞生長，對PMNC細胞生長的抑制效應無明顯增強。本研究結果與Uchida等[14]用Photofrin為聲敏劑報道的相似，他們發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合Photofrin對成人T細胞白血病MT-2細胞生長的抑制效應明顯增強，對PMNC細胞生長抑制效應無明顯變化。說明超聲聯(lián)合Chlorin e6聲動力對SPCA-1細胞生長的作用具靶向性。形態(tài)學上表現(xiàn)為SPCA-1細胞死亡率明顯增強，說明Chlorin e6聲動力抑制SPCA-1細胞生長作用是通過直接殺傷腫瘤細胞。

目前SDT的研究主要是聲敏劑的開發(fā)，一方面，在血卟啉的基礎上進行各種結構調整或化學修飾，產生如ATX-10、ATX-70、DCPH-P-Na I[20]等衍生物，降低了光毒性；另一方面，出現(xiàn)抗癌藥物[21]、抗炎藥物[22]等非卟啉類聲敏劑，在超聲照射下對腫瘤有一定的殺傷效果。鑒于既往的研究已顯示Chlorin e6具低毒、腫瘤特異性聚集高、正常組織清除快和光毒副作用低等優(yōu)點[7-9]。本研究Chlorin e6具聲動力作用的結果表明Chlorin e6有望成為一個用于聲動力治療NSCLC的新型聲敏劑，其作用有待在整體動物加以證實，是否具有普遍性有待在其他肺癌細胞、其他腫瘤細胞加以證實，是否優(yōu)于其他聲敏劑有待與其他光聲敏劑比較。