許崇安 馮丹 李琳 于萍 胡雪君 劉云鵬

肺癌的發(fā)病率及死亡率不僅在歐美國(guó)家位居首位[1]，在我國(guó)也已成為城市居民惡性腫瘤死亡率的第一位[2]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占全部肺癌的80%[3]，由于肺癌起病隱匿，目前仍缺乏有效的篩查和早期診斷方法，患者出現(xiàn)癥狀時(shí)多為晚期，預(yù)后較差，總的5年生存率不超過15%，有癥狀者≤10%[4]。很多病人在接受根治性手術(shù)后仍會(huì)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，單憑臨床病理分期已不能對(duì)預(yù)后做出準(zhǔn)確評(píng)估，因此，有必要研究不同的分子標(biāo)志物在肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的作用。

DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在維持基因組功能完整性、修復(fù)致癌因素所致的損傷以及抗癌過程中起到極為重要的作用[5]，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 1（excision repair cross complementing 1, ERCC1）是DNA修復(fù)系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵基因，在多種DNA損傷中發(fā)揮修復(fù)作用，與惡性腫瘤的發(fā)生、預(yù)后及治療反應(yīng)等密切相關(guān)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-Pi（glutathione S-transferase Pi, GST-pi） 是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的II相代謝酶，是細(xì)胞抗損傷抗癌變的重要解毒系統(tǒng)[6]。為了進(jìn)一步研究與肺癌相關(guān)的分子標(biāo)志物特點(diǎn)，我們應(yīng)用組織芯片和免疫組化方法，檢測(cè)148例肺癌標(biāo)本中ERCC1和GST-pi的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院1997年1月-2004年12月外科手術(shù)切除并有完整臨床資料的肺癌石蠟包埋標(biāo)本148例，男性104例，女性44例，年齡34歲-76歲，中位年齡58.52歲，有吸煙史93例，無吸煙史55例；病理類型為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）22例，NSCLC 126例，NSCLC中鱗癌50例，腺癌61例，腺鱗癌1例，類癌1例，大細(xì)胞癌6例，多形性癌7例；分化程度為高分化20例，中分化 59例，低分化 41例，未分化28例；根據(jù)UICC1997年新的修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：I期56例，II期25例，III期67例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者83例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者65例；所有患者術(shù)前均未接受過化療、放療或免疫治療。對(duì)照組標(biāo)本選取7例遠(yuǎn)離腫瘤組織（＞5 cm）的正常肺組織。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作 將NSCLC和正常對(duì)照標(biāo)本制作成組織芯片（技術(shù)由上海芯超生物科技有限公司提供），簡(jiǎn)要制作步驟如下：存檔切片經(jīng)病理專家復(fù)診，并進(jìn)行組織學(xué)定位后，再選取對(duì)應(yīng)的蠟塊，以備制作組織芯片使用。應(yīng)用組織陣列儀打孔取材（直徑1.0 mm），每塊取兩點(diǎn)，制作成陣列塊；應(yīng)用切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為4 μm；撈片，烤片及染色后再次復(fù)診，制作成可供免疫組化染色使用的組織芯片數(shù)張。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組化S-P方法檢測(cè)ERCC1和GST-pi的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。ERCC1鼠抗人單克隆抗體濃縮型購(gòu)自美國(guó)Neomarkers公司，工作濃度為1:100，GST-pi鼠抗人多克隆抗體即用型及SP免疫組化試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，選用提供的陽(yáng)性切片在同一條件下染色作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 染色結(jié)果由兩名有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的研究者應(yīng)用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)獨(dú)立進(jìn)行判定，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，意見不同時(shí)協(xié)商解決。ERCC1以胞核中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%記作陽(yáng)性（+），無陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞＜10%記為陰性（-）。GST-pi以胞質(zhì)和（或）胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥20%記作陽(yáng)性（+），無陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞＜20%記為陰性（-）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，ERCC1和GST-pi之間表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩和相關(guān)分析；生存數(shù)據(jù)分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；對(duì)影響生存預(yù)后的聯(lián)合效應(yīng)采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，納入的變量為年齡、性別、吸煙、病理類型、分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ERCC1和GST-pi的表達(dá)；Ρ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有檢驗(yàn)和Ρ值均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1和GST-pi在肺癌和正常肺組織中的表達(dá) 148例肺癌中（圖1A，圖1C），ERCC1陽(yáng)性（圖1B，圖2A）56例（37.8%），GST-pi陽(yáng)性（圖1D，圖2B）109例（73.6%），而7例正常肺組織中二者表達(dá)均為陰性。肺癌標(biāo)本中ERCC1（Ρ=0.042）和GST-pi（Ρ＜0.001）的表達(dá)明顯高于正常肺組織。

2.2 ERCC1和GST-pi的表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系ERCC1陽(yáng)性表達(dá)在NSCLC、中高分化和吸煙指數(shù)＜400的患者中明顯升高（Ρ值分別為0.039、0.016和0.049），GST-pi陽(yáng)性表達(dá)在無吸煙者（Ρ=0.034）及NSCLC患者（Ρ＜0.001）中明顯升高，二者表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)（Ρ值均大于0.05）（表1）

表 1 ERCC1和GST-pi的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab 1 the relationship between ERCC1 expression , GST-pi expression and clinical pathophysicological characteristics of lung cancer patients

2.3 ERCC1和GST-pi表達(dá)的相關(guān)性 Spearman秩和相關(guān)分析結(jié)果顯示，ERCC1和GST-pi的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.214,Ρ=0.009）。

2.4 ERCC1和GST-pi的表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系 148例肺癌病人的5年總生存率為37.4%，Kaplan-Meier生存分析顯示，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)者5年總生存率優(yōu)于陰性患者（Ρ=0.037）（圖3A），分層分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者中ERCC1陽(yáng)性患者的5年生存率明顯高于ERCC1陰性患者（χ2=4.058, Ρ=0.044）（圖3B），而SCLC患者中ERCC1的表達(dá)對(duì)生存無明顯影響（χ2=0.225, Ρ=0.635）。進(jìn)一步分析顯示，I 期和II期患者的5年生存率顯著優(yōu)于III期患者（χ2=17.427, Ρ＜0.001）（圖3C），并且I期和II期患者ERCC1陽(yáng)性的的5年生存率亦顯著優(yōu)于III期ERCC1陽(yáng)性患者（χ2=17.849, Ρ＜0.001）（圖3D）。GST-pi表達(dá)陽(yáng)性與否對(duì)5年生存率無明顯影響（Ρ=0.614），分層分析顯示無論NSCLC還是SCLC患者GST-pi的表達(dá)對(duì)生存均無明顯影響（Ρ均＞0.05）。分析ERCC1和GST-pi都表達(dá)或都不表達(dá)或只有一種表達(dá)之間5年生存率的差異，結(jié)果顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.303, Ρ=0.254）

圖 1 肺癌組織芯片及一個(gè)點(diǎn)的ERCC1和GST-pi的陽(yáng)性表達(dá)A：ERCC1肺癌組織芯片；B：一個(gè)點(diǎn)的ERCC1陽(yáng)性表達(dá)（SP，×100）；C：GST-pi肺癌組織芯片；D：一個(gè)點(diǎn)的GST-pi陽(yáng)性表達(dá)（SP，×100）。Fig 1 the tissue microarray of lung cancer and the positive expressions of ERCC1 and GST-pi in one site of lung cancer tissueA, C: the tissue microarray of lung cancer; B: the positive expressions of ERCC1 in one site of lung cancer tissue (SP, ×100); D: the positive expressions of GST-pi in one site of lung cancer tissue (SP, ×100).

圖 2 ERCC1和GST-pi在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)（SP，×400）Fig 2 the expressions of ERCC1 and GST-pi in NSCLC tissue (SP, ×400)

圖 3 患者的生存曲線A：ERCC1陽(yáng)性和陰性表達(dá)患者的生存曲線（Ρ=0.037）；B：ERCC1陽(yáng)性和陰性表達(dá)的NSCLC患者生存曲線（Ρ=0.044）；C：I/ II 期和III期患者的生存曲線（Ρ=0.037）；D：I/ II期ERCC1陽(yáng)性和III期ERCC1陽(yáng)性患者的生存曲線（Ρ＜0.001）。Fig 3 the Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patientsA: the Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with positive and negative ERCC1 expression (Ρ=0.037);B: the Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with positive and negative ERCC1 expression (Ρ=0.044);C: the Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with stage I/II and stage III (Ρ=0.037);D: the Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients with stage I/ II ERCC1 positive and stage III ERCC1 positive (Ρ＜0.001).

Cox多因素分析結(jié)果顯示，NSCLC患者中腫瘤大?。é?0.028, 95%CI: 1.087-4.378, RR=2.181）和臨床分期（Ρ=0.019, 95%CI: 1.076-2.279, RR=1.566）是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；ERCC1和GST-pi的表達(dá)不是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在SCLC患者中，腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ERCC1和GST-pi的表達(dá)等均不是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

ERCC1是DNA修復(fù)基因，定位于19號(hào)染色體上，是核苷酸剪切修復(fù)家族中的一個(gè)重要成員，編碼297個(gè)氨基酸，與XPF形成異源二聚體，在DNA單鏈?zhǔn)軗p處的5'端進(jìn)行剪切而發(fā)揮功能。研究證實(shí)DNA修復(fù)基因的修復(fù)能力與肺癌的發(fā)病和耐藥有關(guān)，DNA修復(fù)基因修復(fù)力低者肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)較正常人明顯增加，而修復(fù)能力高者常對(duì)化療藥物耐藥，使化療失敗[7-9]。

我們[10]曾檢測(cè)了ERCC1在116例NSCLC和12例癌旁肺組織中的表達(dá)，陽(yáng)性率分別為40.5%和16.7%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達(dá)與肺癌分化程度、腫瘤大小和TNM分期密切相關(guān)，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)組5年生存率高于陰性表達(dá)組。Simon等[8]檢測(cè)了51例NSCLC患者術(shù)后癌組織中的ERCCI表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達(dá)與吸煙情況無關(guān)。本文的研究發(fā)現(xiàn)ERCC1在肺癌中的表達(dá)高于正常肺組織（Ρ=0.042），并且ERCC1表達(dá)在吸煙指數(shù)小于400的患者中明顯升高（Ρ=0.049），上述研究結(jié)果的差異分析與樣本來源不同有關(guān)。目前有關(guān)ERCC1在肺鱗癌及腺癌中的表達(dá)情況研究尚有爭(zhēng)議，Simon等[8]的研究結(jié)果顯示ERCC1在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌，而Wachters等[11]報(bào)道肺鱗癌中的ERCC1表達(dá)顯著高于肺腺癌。我們以前的研究[10]結(jié)果顯示ERCC1在肺鱗癌及腺癌中的表達(dá)無顯著差異，本文的研究結(jié)果進(jìn)一步顯示ERCC1在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于小細(xì)胞肺癌患者（Ρ=0.039）。Olaussen等[12]研究顯示，ERCC1表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期無關(guān)，與我們的研究結(jié)果相一致。ERCC1的表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系目前尚未明確，多數(shù)研究顯示在早期術(shù)后患者中ERCC1高表達(dá)者生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，可作為指導(dǎo)預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[8]，但也有相反的結(jié)果，Azuma等[13]研究顯示ERCC1陰性的早期肺癌患者比陽(yáng)性者有更長(zhǎng)的無進(jìn)展生存期。與早期肺癌相反，在接受鉑類化療的晚期NSCLC患者中，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)示著對(duì)鉑類化療耐藥，常常導(dǎo)致化療失敗，因此，晚期NSCLC患者ERCC1陽(yáng)性表達(dá)者反較陰性表達(dá)者預(yù)后差[12]。這是因?yàn)镋RCC1在腫瘤不同的階段具有不同的作用，通過預(yù)防突變，ERCC1可減少癌癥的發(fā)生或者阻止已經(jīng)存在的腫瘤進(jìn)展。因此，對(duì)于未進(jìn)行化療的早期NSCLC患者，ERCC1是預(yù)后良好的標(biāo)志；而對(duì)于晚期NSCLC，若進(jìn)行化療則可能導(dǎo)致耐藥。因此，ERCC1對(duì)于NSCLC患者治療的選擇存在2種情況：早期患者，ERCC1高表達(dá)則可以不進(jìn)行輔助化療；晚期患者，ERCC1高表達(dá)，則不適合應(yīng)用含鉑類為基礎(chǔ)的方案化療，可使用非鉑類方案化療，也可根據(jù)EGFR基因檢測(cè)結(jié)果選用EGFR通路的TKI抑制劑。我們的研究結(jié)果表明ERCC1陽(yáng)性的肺癌患者預(yù)后優(yōu)于陰性患者，并與生存顯著相關(guān)（Ρ=0.037），這可能是因?yàn)槲覀兊牟±蠖鄶?shù)是接受可能治愈性手術(shù)的早期肺癌患者有關(guān)。雖然ERCC1表達(dá)總體上并非是預(yù)后的獨(dú)立因素，但分層分析發(fā)現(xiàn)，ERCC1的表達(dá)是影響I期和II期患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（Ρ=0.003），而III期患者ERCC1的表達(dá)不是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另外，I期和II期ERCC1陽(yáng)性患者的5年生存率亦顯著優(yōu)于III期ERCC1陽(yáng)性患者。分層分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者中ERCC1陽(yáng)性患者的5年生存率明顯高于ERCC1陰性患者，SCLC患者中ERCC1的表達(dá)對(duì)生存無顯著影響。

GST-pi是人體內(nèi)一種II相代謝酶。其對(duì)腫瘤的耐藥作用主要由其解毒功能引起，作用機(jī)制為：①催化谷胱苷肽（GSH）與親電子藥物如各種烷化劑結(jié)合，增加其水溶性，加速其排泄而使藥效減低；②清除葸環(huán)類藥物等產(chǎn)生的自由基，減輕藥物自由基對(duì)細(xì)胞的損傷；③通過直接與藥物結(jié)合的形式降低藥物活性；④GST-pi還具有GSH過氧化物酶活性，可將有毒的過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)榈投镜拇碱愇镔|(zhì)，即有阻斷脂質(zhì)過氧化物的作用。

NSCLC對(duì)化療的敏感性不如SCLC，其中一個(gè)重要的差異就是GST-pi表達(dá)的差異。GST-pi在不同肺癌組織類型中的表達(dá)目前報(bào)道不一。我們以前的研究[14]發(fā)現(xiàn)GST-pi在肺腺癌中的表達(dá)明顯高于鱗癌，不同分化程度的NSCLC中GST-pi的表達(dá)無明顯差異，吸煙者GST-pi的表達(dá)低于不吸煙者；Allen等[15]的研究也有相似的結(jié)論。而王笑新等[16]研究發(fā)現(xiàn)GST-pi在鱗癌中的表達(dá)高于腺癌。我們的研究結(jié)果顯示GST-pi在肺鱗癌及腺癌中的表達(dá)高于SCLC，分層分析顯示GST-pi在鱗癌和腺癌中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ=0.477）；GST-pi在非吸煙患者中的表達(dá)明顯高于吸煙患者。GST-pi的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等無關(guān)。Hirano等[17]的研究顯示NSCLC患者接受鉑類為基礎(chǔ)的化療療效與GST-pi的表達(dá)有關(guān)，GST-pi陰性表達(dá)組5年生存率優(yōu)于陽(yáng)性組。我們以前的研究[14]顯示GST-pi的表達(dá)與生存無相關(guān)，本次研究結(jié)果進(jìn)一步顯示無論NSCLC還是SCLC患者GST-pi的表達(dá)對(duì)生存均無影響（Ρ均＞0.05）。

DNA修復(fù)基因的修復(fù)能力與肺癌的發(fā)病和耐藥有關(guān)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是細(xì)胞抗損傷抗癌變的重要解毒系統(tǒng)，我們的研究結(jié)果顯示ERCC1和GST-pi在NSCLC中表達(dá)明顯增高并且相關(guān)，提示二者在腫瘤形成及鉑類耐藥過程中可能有一定聯(lián)系，但是否存在相互調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

致謝：對(duì)參與本文病理結(jié)果判定的中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理專家邱雪杉教授和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（盛京醫(yī)院）病理專家楊向紅教授表示由衷的謝意！