賴穎暉,賴永榕,楊高暉

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科,廣西南寧 530021)

介導(dǎo)人α-反義寡核苷酸慢病毒載體的構(gòu)建

賴穎暉,賴永榕*,楊高暉

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科,廣西南寧 530021)

目的構(gòu)建介導(dǎo)人α-反義寡核苷酸的慢病毒載體,為α-反義寡核苷酸對(duì)β-地中海貧血基因治療的體內(nèi)試驗(yàn)提供穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞載體。方法根據(jù)人α-反義寡核苷酸序列設(shè)計(jì)siRNA、合成DNA片段,通過(guò)雙限制性內(nèi)切酶消化和連接的方法構(gòu)建pGCSIL-vshR NA-GFP載體質(zhì)粒,接著該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌E.coliDH5α,通過(guò)PCR及基因測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆,再經(jīng)Lipofectamine 2000將pGCSIL-vshRNA-GFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞包裝病毒,通過(guò)綠色熒光蛋白的表達(dá)測(cè)定收集的病毒滴度。結(jié)果重組質(zhì)粒的外源基因PCR鑒定正確,基因測(cè)序結(jié)果與所需要的α-反義寡核苷酸序列完全一致,濃縮后病毒滴度為5×109TU/ml。結(jié)論成功構(gòu)建介導(dǎo)人α-反義寡核苷酸的慢病毒載體。

慢病毒載體;反義寡核苷酸;基因治療

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1358)

β-地中海貧血是一種對(duì)人類健康危害嚴(yán)重的遺 傳性溶血性疾病。對(duì)重型β-地中海貧血,臨床上缺乏有效的治療手段,病人依賴于長(zhǎng)期輸血及去鐵治療來(lái)維持生命,費(fèi)用巨大,死亡率極高[1]。造血干細(xì)胞移植是唯一的根治方法,但是由于合適供體來(lái)源

受限及費(fèi)用昂貴,臨床上難以廣泛開(kāi)展。基因治療成為了β-地中海貧血治療的希望。劉容容等[2]的研究所篩選出的反義寡核苷酸(ASON)能高效抑制人α-珠蛋白基因表達(dá),并能有效地抑制體外培養(yǎng)的重型β-地中海貧血紅系細(xì)胞α-珠蛋白基因表達(dá),從而改善α/β+γ珠蛋白基因的比例失衡。本研究構(gòu)建介導(dǎo)上述人α-ASON的慢病毒載體,并包裝純化慢病毒顆粒,為后續(xù)的α-ASON對(duì)β地中海貧血基因治療的體內(nèi)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 病毒載體(pGC-LV重組載體,pHelper 1.0,pHelper 2.0)(上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司);293T(上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司);Age I和EcoRI(NEB);250bp DNA ladder Marker(捷瑞);Lipofectamine 2000(Invitrogen)。凝膠成像儀(天能公司),細(xì)菌搖床(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司),細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),PCR儀(Applied Biosystems),熒光顯微鏡(奧林帕斯 micropublisher 3.3RTV),CO2培養(yǎng)箱(SANYO)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 siRNA設(shè)計(jì) 根據(jù)劉容容等[3]篩選出的靶向人α-珠蛋白基因mRNA翻譯起始區(qū)、能高效抑制α-珠蛋白基因表達(dá)的ASON 序列(5′-CAGCACCATGGTGGGTTCTC-3′),設(shè)計(jì) siRNA 序列 為 CAGCACCATGGTGGGTTCTC。病毒載體構(gòu)建框架見(jiàn)表1。

表1 病毒載體構(gòu)建框架

1.2.2 合成DNA片段 合成片段信息:

PSCSI1907-1 CcggCAGCACCATGGTGGGTTCTCTTCAAGAGAGAGAACCCACCATGGTGCTGTTTTTg;PSCSI-1907-2 aattcaaaaaCAGCACCATGGTGGGTTCTCTCTCTTG AAGAGAACCCACCATGGTGCTG

委托上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成引物。引物退火。

1.2.3 將α-ASON序列連接入慢病毒載體 Age I和EcoRI酶切pGCSIL-GFP載體以使其線性化。連接反應(yīng)體系見(jiàn)表2。于16℃連接過(guò)夜。

表2 連接反應(yīng)體系

1.2.4 轉(zhuǎn)化 用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ l轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中,每管加2 μ l連接液,混勻,在冰中放置30 min。將管放到42℃水浴中90 s,再快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1-2 min。每管加800 μ l SOC培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃,然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上,溫育 45 min使細(xì)菌復(fù)蘇。將150 μ l已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20 mmol/L MgSO4和 Amp 抗性(100 μ g/ml)的 LB 瓊脂培養(yǎng)基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿,于37℃培養(yǎng),16 h。

1.2.5 陽(yáng)性克隆的鑒定

(1)陽(yáng)性克隆的PCR鑒定PCR引物序列:Primer(+):5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′,Primer:5′-GTAATACGGTTATCCACGCG-3′;PCR 反應(yīng)體系 :10×buffer 2 μ l,dNTPs(2.5 mM)0.8 μ l,Primer(+)0.4 μ l,Primer(-)0.4 μ l,Taq polymerase 0.2 μ l,Template 1 μ l,ddH2O 補(bǔ)足 20 μ l;PCR 反應(yīng)條件 :94℃,30 sec;94℃、30 sec,55℃、30 sec,72℃、30 sec,30 個(gè)循環(huán);72℃,6 min。菌落PCR模版:在連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長(zhǎng)出菌克隆表面沾一下 ,溶于10 μ l LB,混勻取 1 μ l作為模板;PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳觀察。

(2)挑選陽(yáng)性克隆送基因測(cè)序鑒定。

1.2.6 慢病毒的包裝及滴度測(cè)定

(1)慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前24 h,用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞,以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2×107細(xì)胞/20 ml,重新接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV 載 體 20 μ g,pHelper 1.0 載 體 15 μ g,pHelper2.0 載體 10 μ g),與相應(yīng)體積的 Opti-MEM 混合均勻,調(diào)整總體積為2.5 ml,在室溫下溫育5 min。將Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻,取 100 μ l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 ml Opti-MEM混合,在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合?；旌虾?在室溫下溫育20 min,以便形成 DNA與 Lipofectamine 2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中,混勻,于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基,每瓶細(xì)胞加入20 ml的PBS液以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物,然后倒去。每瓶細(xì)胞中加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基 25 ml,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

病毒的收獲及濃縮:收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液。于4℃,4 000 g離心10 min,除去細(xì)胞碎片。過(guò)濾、濃縮。分裝后保存在病毒管中,-80度長(zhǎng)期保存。取其中一支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。

(2)慢病毒滴度測(cè)定逐孔稀釋法測(cè)定滴度:測(cè)定前一天,為293T細(xì)胞鋪板,96孔板,每個(gè)孔加4×104個(gè)細(xì)胞,體積為100 μ l。根據(jù)病毒的預(yù)期滴度,準(zhǔn)備7-10個(gè)無(wú)菌的Ep管。在每個(gè)管中加入90 μ l的無(wú)血清培養(yǎng)基。取待測(cè)定的病毒原液10 μ l加入到第一個(gè)管中,混勻后,取10 μ l加入到第二個(gè)管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。選取所需的細(xì)胞孔,吸去90 μ l培養(yǎng)基 ,丟棄。加入90 μ l稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后,加入完全培養(yǎng)基100 μ l。4天后,觀察熒光表達(dá)情況。熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而而減少。滴度計(jì)算:根據(jù)GFP熒光表達(dá)情況,病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。

2 結(jié)果

2.1 人α-ASON重組慢病毒載體的鑒定結(jié)果

2.1.1 陽(yáng)性克隆PCR鑒定

重組慢病毒載體構(gòu)建成功后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。PCR條帶大小:連接入vshRNA片段的陽(yáng)性克隆PCR片段大小為:343 bp(從載體中切掉24 bp);沒(méi)有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為:306 bp。

圖1 陽(yáng)性克隆PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.2 陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果分析 陽(yáng)性克隆送基因測(cè)序結(jié)果如圖2,與所需要的α-ASON序列完全一致。

2.2 人α-ASON重組慢病毒的滴度測(cè)定結(jié)果

在加入1×10-6μ l病毒原液的孔中觀察到5個(gè)帶有熒光的細(xì)胞,如圖3。說(shuō)明該孔中至少有5個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞,則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量,就是5/(1×10-6)=5×106,單位為 TU/μ l,等于 5×109TU/ml。

3 討論

β-地中海貧血的主要病理基礎(chǔ)是由于α珠蛋白鏈的相對(duì)過(guò)剩,剩余的α珠蛋白鏈在紅細(xì)胞內(nèi)形成包涵體,導(dǎo)致紅細(xì)胞膜的氧化損傷,造成紅細(xì)胞破壞及骨髓的無(wú)效造血[4]。國(guó)外研究者認(rèn)為適當(dāng)下調(diào)內(nèi)源性α-珠蛋白基因表達(dá),減少α-珠蛋白肽鏈合成可能比增加β-珠蛋白肽鏈生成更有助于改善β-地中海貧血患者癥狀[5]。劉容容等[2,3]設(shè)計(jì)并篩選出能高效抑制α珠蛋白基因表達(dá)的α-ASON,并證實(shí)該α-ASON能有效地抑制體外培養(yǎng)的重型β-地中海貧血紅系細(xì)胞α-珠蛋白基因表達(dá),改善珠蛋白基因α/β+γ的比例失衡,使其紅系細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩α-珠蛋白肽鏈的沉積明顯減少。而α-ASON對(duì)于β-地中海貧血的體內(nèi)試驗(yàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。基因治療載體系統(tǒng)是關(guān)系到基因治療成敗的重要因素之一。理想的載體應(yīng)能有效的轉(zhuǎn)移一個(gè)或多個(gè)功能基因,并且具有特異的靶向性,不被免疫系統(tǒng)識(shí)別,可以穩(wěn)定、方便的擴(kuò)增,高濃度的大量純化,不會(huì)引起炎癥,對(duì)受體和環(huán)境安全,并能按適當(dāng)?shù)恼{(diào)控模式表達(dá)攜帶的外源基因[6]。慢病毒為反轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞科,它既可以感染分裂細(xì)胞又可感染非分裂細(xì)胞,研究表明慢病毒載體還具有轉(zhuǎn)移的基因片段容量較大(9kb)、目的基因可整合至靶細(xì)胞基因組長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn),且慢病毒載體對(duì)造血干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種基因治療的重要靶向細(xì)胞都有極好的細(xì)胞嗜性,因此慢病毒是基因治療的較理想的載體;最為人們熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV),復(fù)制缺陷型HIV-1可被用于基因轉(zhuǎn)移,HIV-1具有簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒的3個(gè)基因(gag、pol和env),此外還有6種輔助蛋白基因(tet、rev、vpr、nef和 vif)[6]。May等[7]在2000年首次報(bào)道用慢病毒載體對(duì)β-地中海貧血鼠模型進(jìn)行基因治療。Chen等[8]的研究顯示,靜止的造血干細(xì)胞被慢病毒載體有效轉(zhuǎn)染,同時(shí)干細(xì)胞在體內(nèi)自我更新和正常的種系特點(diǎn)不被損傷;用慢病毒載體有效的把基因?qū)氲绞蟾杉?xì)胞,將使在諸如鐮狀細(xì)胞貧血和地中海貧血的血紅蛋白疾病鼠模型,能進(jìn)行基因治療的直接試驗(yàn)。此外,綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因具有觀察簡(jiǎn)單方便和直觀的優(yōu)點(diǎn),只要有足夠的表達(dá),可以直接進(jìn)行活觀察,克服了其他報(bào)告基因需要底物及維持時(shí)間短的缺點(diǎn)[9,10]。

圖2 陽(yáng)性克隆基因測(cè)序結(jié)果

圖3 人α-ASON重組慢病毒的滴度測(cè)定(加入 1×10-6μ l病毒原液)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了報(bào)告基因GFP和α-ASON序列融合的慢病毒載體三質(zhì)粒系統(tǒng),通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)出病毒顆粒,并獲得了5×109TU/ml較高的病毒滴度。PCR鑒定正確,基因測(cè)序結(jié)果與所需要的α-ASON序列完全一致。實(shí)驗(yàn)采用的慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體,它可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期的表達(dá)且安全性高,其為“自殺”性病毒,即病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞,也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒。實(shí)驗(yàn)采用的慢病毒載體系統(tǒng)由pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體三質(zhì)粒組成。pGC-LV載體中含有HIV的基本元件5′LTR和3′LTR以及其他輔助元件。通常根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康尼槍?duì)pGC-LV載體改造以進(jìn)行啟動(dòng)子活性研究、基因表達(dá)研究、RNA干擾等研究。pHelper 1.0載體中含有HIV病毒的gag基因,編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白;pol基因,編碼病毒特異性的酶;rev基因,編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2.0載體中含有單純皰疹病毒來(lái)源的VSV-G基因,提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。普通HIV-1載體借助其包膜表面的gpl20蛋白(由env基因編碼)只能感染CIM(+)T細(xì)胞,當(dāng)用水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G或雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白取代HIV本身的包膜蛋白后,不僅進(jìn)一步降低了HIV-1載體恢復(fù)成野生型病毒的可能同時(shí)由于VSV的包膜賦予HIV載體顆粒高度的穩(wěn)定性,使其能夠通過(guò)超速離心濃縮而達(dá)到高滴度;更重要的一點(diǎn)是包膜替換擴(kuò)大了HIV-1載體的嗜性范圍,使其幾乎能感染所有組織來(lái)源的細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等[11-14]。

目前大多數(shù)研究者都使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的方式生產(chǎn)病毒載體。這種方法的缺點(diǎn)在于生產(chǎn)獲得的病毒載體可能會(huì)出現(xiàn)有缺陷的基因組。為了生產(chǎn)高質(zhì)量的載體,必須篩選合適的包裝細(xì)胞系,而建立包裝細(xì)胞系的最大難點(diǎn)在于某些病毒蛋白具有細(xì)胞毒性。目前,為了建立合適的慢病毒載體包裝細(xì)胞系,許多科學(xué)家都在嘗試使用誘導(dǎo)型或可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子來(lái)克服病毒蛋白的細(xì)胞毒作用[15,16]。本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝病毒顆粒,效果較滿意。而慢病毒載體滴度可以參考腺病毒載體滴度的檢測(cè)方法[6],將病毒與293細(xì)胞共培養(yǎng)后,通過(guò)熒光顯微鏡觀察GPF熒光表達(dá)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP蛋白表達(dá)水平來(lái)分析病毒滴度。另外,還可以通過(guò)TaqMan PCR檢測(cè)細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)的方法檢測(cè)滴度。由于熒光顯微鏡觀察GPF熒光表達(dá)具有方便、簡(jiǎn)單和直觀的優(yōu)點(diǎn),本研究采用此方法來(lái)分析計(jì)算病毒滴度。經(jīng)測(cè)定,本研究人α-ASON重組慢病毒的滴度達(dá)到了5×109TU/ml,且基因測(cè)序結(jié)果與所需要的α-ASON序列完全一致。因此,本研究成功構(gòu)建了介導(dǎo)人α-ASON的慢病毒載體并包裝純化慢病毒顆粒,為α-ASON對(duì)β地中海貧血基因治療的體內(nèi)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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Construct recombinant lentiviral vectors carrying human α-antisense oligonucleotide

LAI Ying-hui,LAI Yong-rong,YANG Gao-hui.(Department of Hematology,the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning530021,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vectors carrying human α-antisense oligonucleotide.MethodsAccording to the human α-antisense oligonucleotide sequence,pGCSIL-vshRNA-GFP plasmid was constructed by double restriction enzyme digestion and ligation,and then the plasmidwas transformed into E.coliDH5α.Purified pGCSIL-vshRNA-GFP plasmids from the positive clones was confirmed by PCR and sequencing.293T cells were cotransfected with lentiviral vector pGCSIL-vshR NA-GFP,pHelper 1.0 and pHelper 2.0 by Lipofectamine 2000 to produce lentivirus.The titer of virus was tested according to the expression level of green fluorescent protein.ResultsThe exogenous gene sequence of the recombinant plasmids was completely in accordance with that of the human α-antisense oligonucleotide.The titer of concentrated virus was 5×109TU/ml.ConclusionThe recombinant lentiviral vectors carrying humanα-antisense oligonucleotide are successfully constructed.

Lentiviral vector;Antisense oligonucleotide;Gene therapy

R392

A

1007-4287(2010)09-1358-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30860307),廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目

*通訊作者

2010-05-10)