張 娜，高 萍，王文彤，陶遵威，鄭 奪（天津市醫(yī)藥科學研究所，天津市 300020）

鹽酸左氧氟沙星是第3代氟喹諾酮類抗菌藥物，具有水溶性好、活性強、廣譜、毒副作用低等特點，對細菌性結膜炎和角膜炎等眼科感染有良好的療效，具有廣泛的臨床應用前景[1]。本文選用殼聚糖和膠原蛋白為增效劑及增稠劑制備了鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液，延緩了其在眼部釋藥時間，提高了生物利用度，并參考GB/T 16886.5-2003《醫(yī)療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗》[2]中試驗方法評價了該滴眼液的體外細胞毒性，參照《藥理實驗方法學》評價了其急性毒性和皮膚刺激反應[3]，保證安全給藥的同時還為進一步開展臨床試驗提供了科學依據。

1 材料

1.1 細胞與動物

小鼠成纖維細胞（簡稱L-929細胞，中國藥品生物制品檢定所）；昆明種小白鼠，♂♀各半，體質量17～20 g，合格證號：SCXK（京）2007-0001；大耳白兔，♂♀各半，體質量2.0～2.5 kg，合格證號：SCXK（京）2005-0002，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 試藥

RPMI 1640細胞培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；胎牛血清和胰蛋白酶（美國Sigma公司）；高密度聚乙烯（江門市新會區(qū)浩天工貿有限公司，批號：081218）；瓊脂粉（北京三藥科技開發(fā)公司生產，批號：061219）；0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號：8C93B）；鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液（自制，批號：081011、081012、081013，規(guī)格：15 mg·5 mL－1）。

1.3 儀器

MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器和MCO-18AIC（UV）型CO2培養(yǎng)箱均由日本Sanyo公司提供；W-7401超凈工作臺（德國Steag公司）；TMS型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 體外細胞毒性試驗

2.1.1 樣品的制備。試驗樣品：將0.1 mL鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液滴在直徑10 mm的8層濾紙圓片上；陰性對照：直徑為10 mm的高密度聚乙烯圓片；陽性對照：涂有鄰苯二甲酸二辛酯的直徑為10 mm的聚氯乙烯圓片；生理鹽水對照：將0.1 mL生理鹽水滴在直徑10 mm的8層濾紙圓片上。

2.1.2 操作步驟。采用瓊脂擴散法[2]檢測細胞毒性：取正常傳代的L-929細胞10 mL，接種于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內，每皿接種細胞3×106個，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入10 mL瓊脂培養(yǎng)基（3%瓊脂與2倍的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液按1∶1混合），待其凝固后，每一平皿內放陰、陽性及生理鹽水對照各1片、試驗樣品2片、平行操作5皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24 h，棄去所有樣品（試驗樣品，陰、陽性及生理鹽水對照），用0.01%中性紅染色20 min后進行結果評定。

2.1.3 評定指標[2]。用倒置顯微鏡觀察試驗樣品和陰、陽性及生理鹽水對照圓片下及周圍褪色區(qū)域，并按表1所示指標評價每一樣品的褪色指數和溶解指數，再按表2確定各組細胞毒性反應的分級，表1、表2見下。

表1 褪色指數和溶解指數評價標準Tab 1 Evaluation standard of fading index and dissolving index

表2 細胞反應分級評價標準Tab 2 Evaluation standard for the grade of cellular reaction

2.2 急性毒性實驗[3]

選小鼠20只，平均分為供試品組和空白對照組，每組10只，均采用靜脈注射方式給藥，供試品組以鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液按15 mg·kg－1給藥1次，相當于成人臨床日用量的（成人每日鹽酸左氧氟沙星為4.5 mg，按成人體質量60 kg計算，劑量為0.075 mg·kg－1）200倍；空白對照組給相同體積的生理鹽水。注射完畢后，觀察14 d小鼠的一般狀態(tài)和死亡數，并記錄體質量變化。

2.3 皮膚刺激反應實驗

2.3.1 實驗步驟。選用大耳白兔12只，實驗前24 h剪剃其背部脊柱兩側被毛備皮，去毛范圍為3 cm×3 cm，隨機分為皮膚完好組和皮膚破損組，每組6只，另在皮膚破損組兔的脊柱兩側用無菌針頭劃成“#”，以滲血為準。采用同體左右側自身對照，將鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液滴到2.5 cm×2.5 cm的紗布塊上，敷貼在左側背部，陰性對照將生理鹽水滴到2.5 cm×2.5 cm的紗布塊上，敷貼在右側背部，用半封閉性包扎帶固定6 h，每次用量均為1.5 mg·d－1，每天1次，連續(xù)用藥7 d。末次用藥24 h后，用溫水去除殘留藥物，分別于1、24、48、72 h連續(xù)觀察并記錄涂藥部位有無紅斑及水腫等情況。

2.3.2 評定指標。紅斑和水腫按以下標準進行評分[3]：無紅斑0分，紅斑勉強可見為1分，紅斑明顯可見2分，嚴重紅斑3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成4分；無水腫0分，水腫勉強可見1分，邊緣高出周圍皮膚的水腫2分，皮膚隆起約1 mm、輪廓清楚的水腫為3分，皮膚隆起1 mm以上范圍擴大的水腫4分。平均分值＝（紅斑反應總分+水腫反應總分）/每組動物數，按平均分值進行刺激強度[4]評價，皮膚刺激強度評價標準見表3。

表3 皮膚刺激強度評價標準Tab 3 Evaluated standard of skin irritation

3 結果

3.1 體外細胞毒性

各組褪色指數和溶解指數結果詳見表4。

表4 各組細胞褪色指數和溶解指數結果Tab 4 Results of fading index and dissolving index

由表4分析可知，陰性對照、陽性對照、生理鹽水對照、試驗樣品的細胞毒性反應分別為0、2、1、1級。

3.2 急性毒性

注射后小鼠在觀察期狀況良好，活動、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無驚厥、癱瘓和死亡等毒性反應，小鼠體質量日漸增加。利用SPSS統(tǒng)計軟件將空白對照組和供試品組每天的體質量進行組間t檢驗分析，結果見表5。

表5 各組小鼠體質量比較（g，±s，n＝10）Tab 5 Comparison of body weight of mic（eg，±s，n＝10）

表5 各組小鼠體質量比較（g，±s，n＝10）Tab 5 Comparison of body weight of mic（eg，±s，n＝10）

空白對照組17.7±0.5 18.5±0.8 20.2±0.8 21.9±0.8 23.6±0.8 26.6±0.7 31.6±0.6時間/d 1 2 3 5 7 1 0 14供試品組17.5±0.6 18.3±1.0 19.7±1.1 21.3±1.3 22.8±1.3 25.6±1.5 30.4±1.5

由表5可知，供試品組與空白對照組小鼠在14 d內體質量變化沒有明顯差異，表明該滴眼液對實驗小鼠體質量沒有明顯影響。

3.3 皮膚刺激反應

除去敷貼物后1、24、48、72 h，觀察各部位皮膚組織反應情況，皮膚完好組兔用藥側、對照側皮膚均未發(fā)現紅斑及水腫，皮膚刺激強度評價均為無刺激性（平均分值為0）。破損皮膚組1、24 h時僅有1只出現紅斑和水腫，48 h后反應平均分值均為0，5 d后傷口均愈合，基本恢復正常狀態(tài)，皮膚刺激評價均為無刺激性（平均分值均小于0.50），具體結果見表6。

表6 各組小鼠皮膚刺激實驗結果Tab 6 Results of dermal irritation test of each group

4 討論

本課題首次將殼聚糖和膠原蛋白同時與鹽酸左氧氟沙星配方組合制備鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液。殼聚糖為甲殼類動物中提取的天然多糖甲殼素的脫乙酰產物，殼聚糖的加入不但增加了藥液的黏度，延長了藥物在眼內的滯留時間，增加了藥物的吸收，而且該物質本身具有消炎、抑菌、止血等功能[4]；另外有文獻[5]數據表明，大、小白鼠口服殼聚糖的半數致死劑量（LD50）＞16 g·kg－1，與蔗糖相當，長期毒性實驗亦無明顯毒性發(fā)生，未發(fā)現誘變性、皮膚刺激性和過敏反應發(fā)生。膠原蛋白是連接組織的主要結構蛋白，膠原蛋白不僅可以作為載體使藥物在眼部緩慢釋放，而且還可以促進角膜上皮細胞損傷的修復和細胞生長[6]，另外膠原蛋白溶液是一種無毒、無刺激、無過敏性的安全新型外用藥物[7]。殼聚糖和膠原蛋白作為新型、安全的生物材料，在眼科疾病治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。

鹽酸左氧氟沙星緩釋滴眼液的體外細胞毒性、急性毒性和皮膚刺激反應均符合相關國家規(guī)范和要求，本實驗研究證明了該滴眼液用藥的安全性，為進一步深入研究和推廣應用提供了的科學實驗依據。

[1]汪榮軍.左氧氟沙星眼用凝膠的制備[J].安徽醫(yī)藥，2006，10（2）：141.

[2]GB/T16886.5-2003，中華人民共和國國家標準[S].

[3]徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：227.

[4]賴善城，盧雪梅.加替沙星殼聚糖滴眼液的制備及質量控制[J].中國藥房，2005，16（24）：1 870.

[5]曾 健，李曉輝，黃鉞華，等.殼聚糖DCX-16的初步安全性評價[J].中國藥房，2005，16（3）：172.

[6]劉慧玲，王 棟，章金剛.膠原蛋白在臨床醫(yī)學中的應用[J].北京生物醫(yī)學工程，2005，24（3）：239.

[7]馮國基，潘建明，吳曉斌，等.膠原溶液的安全性試驗研究[J].廣東藥學，1995，5（4）：39.